我们开发了一种多井格式的聚丙烯酰胺检测方法, 以探讨细胞外基质硬度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测与流式细胞术、染色和牵引力显微镜相兼容, 可以定量测量细胞、胞外基质和致病细菌之间的生物力学相互作用。
细胞外基质刚度包括多种环境机械刺激, 众所周知, 影响细胞的行为, 功能, 和命运的一般。虽然越来越多的黏附细胞类型的反应矩阵的刚度已经被描述, 如何黏附的细胞对细菌感染的敏感性取决于基质刚度是很大的未知, 如细菌感染的影响宿主细胞的生物力学。我们推测宿主内皮细胞对细菌感染的敏感性取决于这些细胞所驻留的基质的刚度, 而细菌宿主细胞的感染会改变其生物力学。为了检验这两种假说, 以内皮细胞为模型宿主, 以李斯特菌为模型致病菌。通过建立一种新的多井格式检测方法, 证明了基质刚度对细胞内内皮细胞感染的影响, 可以通过流式细胞术和染色显微镜进行定量评价。此外, 利用牵引力显微技术, 可以研究l-李斯特菌感染对宿主内皮细胞生物力学的影响。该方法可以分析组织相关力学对黏附细胞细菌感染的影响, 这是了解细胞间生物力学相互作用的关键步骤, 它们的细胞外基质和病原菌。这种方法也适用于多种其他类型的细胞生物力学和反应基板刚度的研究, 其中重要的是能够在每个实验并行执行许多复制。
大多数动物组织中的细胞通常附着在相邻细胞和细胞外基质 (ECM) 上。细胞的锚固对他们的 ECM 是关键的许多细胞过程, 从细胞的运动到细胞增殖和生存1,2。细胞锚定对 ecm 取决于 ecm 构成和刚性。细胞对后者的变化作出反应, 动态地重新排列细胞骨架, 电池 ECM 和细胞的粘连, 这反过来批判地改变细胞生物力学和功能3,4,5,6.ECM 刚度可以在空间 (即解剖位置)、时间 (即衰老) 和病理生理学过程 (如动脉硬化、癌症、感染等) 中变化。例如, 人们普遍认为, 与软矩阵相比, 居住在更硬的内皮细胞会增加它们的 ECM 和相互之间的作用力, 并表现出增加的运动和增殖7,8。同样, 居住在较硬矩阵上的成纤维细胞会向 ecm 传递高收缩力, 并显示增加的增殖、运动和 ECM 产量9、10、11。虽然细胞力学和对 ECM 刚度的反应已被广泛研究的各种细胞类型, 黏附宿主细胞之间的关系, 其 ECM 的硬度, 和细菌感染仍然是很大的未知。
为了研究 ECM 刚度在细菌-宿主细胞相互作用中的作用, 本文选择了李斯特菌 (Lm) 作为模型病原体。Lm 是一种无处不在的食物传播细菌, 它能在各种各样的哺乳动物宿主体内引起全身感染。这种兼性的胞内病原体通过遍历不同类型的血管内皮, 可以从肠道上皮转移到远端器官。如果它破坏血脑屏障, Lm 会引起脑膜炎, 当它穿过胎盘时, 它会导致自发性流产12,13。Lm 可以感染不同的宿主细胞类型, 并可以使用不同的致病策略。lm 感染主要是在上皮细胞的背景下进行的, 而对于 lm 如何感染和绕过血管腔内血管内皮细胞14、15、16的研究, 则知之甚少。此外, 在很大程度上还不知道内皮细胞的 ECM 的刚度是如何调节 Lm 入侵这些宿主细胞并传播的能力。Lm 和几个额外的细菌物种(即立克次体 parkeri) 利用它们感染的宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架侵入他们的细胞质, 促进细胞对细胞的传播17,18,19. 它们通过表达蛋白质, 使它们能够干扰宿主肌动蛋白聚合通路, 并产生肌动蛋白彗星尾巴, 促进其向前推进16,20。由于感染, 宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架需要动态重新排列的方式, 仍然没有充分的特点, 可能影响的生物力学的宿主细胞, 包括他们所施加的物理力量对他们的 ECM 和每个其他。为了检查这些过程, 人类微血管内皮细胞 (HMEC-1) 被选择为模型宿主细胞三的原因: 1. 内皮细胞被称为高度 mechanosensitive, 因为它们经常暴露在不同的物理线索21;2. 我所使用的用于感染内皮细胞的策略在很大程度上仍然未知22;和3。HMEC-1 是一个永生化的细胞系, 因此, 可以很容易地培养和受到遗传操作。
宿主细胞的细菌感染主要是通过在玻璃或聚苯乙烯基质上的播种细胞来研究的, 它们比大多数细胞12、14、23的生理 ECM 明显僵硬。为了检查其硬度与生理相关的基质细胞的感染情况, 并阐明 ECM 刚度对细菌感染细胞的作用, 我们遵循了一种基于制备薄microbead 聚丙烯酰胺水凝胶在多井板上可调谐刚度。所提出方法的新颖之处在于, 它允许同时监测多个条件, 因为它的多井格式和它是兼容的多种技术, 由于特定的方式, 基板的建立。HMEC-1 细胞被播种在这些蛋白涂层的水凝胶, 然后感染了不同的 Lm 菌株, 要么成为荧光在内化或组成性荧光。采用流式细胞仪评价 ECM 刚度对宿主 HMEC-1 细胞感染敏感性的影响。此外, 染色和荧光显微术用于区分附着和内化细菌。最后, 对牵引力显微镜 (TFM) 进行了成功的表征, 表明 Lm 感染对宿主内皮细胞在感染过程中对其基质施加牵引应力的影响。所提出的检测方法可以很容易地进行修改, 以便进一步研究 ECM 刚度对不同细胞系或病原体对黏附细胞感染敏感性的影响。
细胞可以感知各种物理环境的线索, 这不仅会影响细胞的形态, 而且会对它们的基因表达和蛋白质活性产生作用, 从而影响关键细胞功能和行为45,46。细胞的电解质的刚度越来越被视为细胞动力, 分化, 增殖, 最终细胞命运47,48,49的重要调制器。虽然在了解细胞与电解加工之间复杂的生物力学相互作用方面已经有了许多进展, 但对于环境刚度如何影响细胞对细菌感染的敏感性却知之甚少。为便于此类研究, 我们开发了这种新型的多井检测方法, 其基础是制备了可调谐刚度的聚丙烯酰胺水凝胶, 与50的感染测定方法相吻合。传统上, 在玻璃或聚苯乙烯表面对组织培养细胞的细菌感染进行了研究, 其强度比大多数黏附细胞8、51的自然 ECM 要硬 1-3 级。这里所描述的试验开辟了新的公路, 使研究细菌宿主相互作用的生理相关的环境刚度制度。
为了证明所提出的试验的概念, HMEC-1 细胞被选择为模型黏附宿主细胞和 Lm 作为模型细菌病原体。然而, 如果进行适当的修改, 则可以对该化验进行进一步的研究。这种研究可能涉及不同的哺乳动物黏附宿主细胞类型感染的其他病原体, 包括细菌和病毒。对于这种特殊的化验, 凝胶是蛋白质涂层的胶原蛋白 i, 但根据宿主细胞类型, 有可能使用不同的 ECM 蛋白涂层, 如层黏蛋白或纤连蛋白, 以促进附着的宿主细胞的水凝胶52. 另外一个取决于宿主细胞类型的考虑是水凝胶刚度范围的研究。刚度范围应取决于与特定宿主细胞类型相关的生理因素, 以及宿主在给定的刚性水凝胶中形成单层的良好程度.同样, 根据所需检查的模型病原体, 可能需要对此处描述的感染化验进行轻微的修改。
与以往制造聚丙烯酰胺凝胶24、50、53的方法相比, 该试验的创新之处在于所提出的感染试验中纳入了某些独特的特征。首先, 水凝胶是建立在多井玻璃底板上的, 既能同时进行多种条件的筛选, 也能实现某些工序的自动化。同时监测多个条件或检查多个复制是至关重要的, 因为这种方法的结果可能受到宿主细胞通道的影响, 以及添加到感染宿主的细菌的确切数量, 这往往会改变在独立实验之间。另外一个独特的特点是, 水凝胶的高度约40µm, 这是足够薄, 以图像使用常规显微镜。我们表明, 我们可以成功地执行活细胞显微术和细胞固定, 染色后, 影像, 不引入高背景荧光。最后, 水凝胶由两层组成, 上部有嵌入荧光微球, 受限于单个焦平面。此属性确保在成像过程中不会出现焦点光线干扰。珠的存在使两个检查凝胶的表面形貌, 以确保它们是一致的, 并提高性能的 TFM 和 MSM24,32,41。与 TFM 和 MSM, 有可能计算细胞 ECM 和细胞细胞的力量分别对居住在不同刚度矩阵的细胞。利用这种新的检测方法, 可以通过对环境刚度和感染的贡献同时进行比较, 从而对物理力进行测量。在这种方法下, 感染对宿主细胞力学的影响在整个过程中都可以确定。此外, 细胞内应力的演变可以用 MSM 计算, 并可作为衡量的屏障完整性的单层。最后, 鉴于该试验的多井性质, 有可能同时引入药理和遗传扰动与细菌感染, 更深入地研究宿主细胞力学和感染之间的复杂相互作用。
该技术的一个固有局限性在于基底刚度对细胞增殖速率的影响。通常, 在感染化验中, 我们需要确保在不同条件下的宿主细胞密度是相同的。这是因为细胞密度本身会影响寄主对感染的敏感性。作为宿主细胞的 HMEC-1 细胞在水凝胶上播种24小时时, 它们的数量没有显著的差异。然而, 不同的细胞类型可能表现出差异增殖, 取决于水凝胶的硬度, 可以偏倚感染研究。同样, 当细胞不形成单分子膜或不附着在水凝胶上时, 就会出现感染偏差, 如某些细胞类型在非常软的基质上播种 (例如, 人脐内皮细胞或 Madin-达比犬肾上皮细胞种子在 0.6-帕水凝胶54,55)。就病原体而言, 某些细菌 (例如,螺旋体 burdgorferi) 可以附着在宿主细胞上, 并侵入它们, 但也可以通过它们来刺字56。我们还没有测试, 如果这一化验将工作的病原体轮回研究, 但似乎有可能, 因为以前的研究, 对中性粒细胞 transmigrating 内皮细胞种子在 PA 水凝胶已被证明工作成功57。通过混合丙烯酰胺和双丙烯酰胺24、25、26 的适当浓度, 进行了大量的研究, 展示了如何生产给定杨氏模量的聚丙烯酰胺水凝胶. ,27。然而, 特别是当一个人想要对居住在不同刚度的水凝胶上的细胞进行 TFM 实验时, 通过 AFM 或其他压痕技术来确认水凝胶的预期刚度是至关重要的.58。由于使用了不同的溶剂或老化的丙烯酰胺溶液, 或者用 afm 测量的方式 (例如afm 尖端的形状), 可能会产生与预期值稍有偏差的情况。最后, 本文提出的方法是基于2D 矩阵上的种子宿主细胞, 它可以不同于更现实和生理相关的3D 场景。然而, 制造3D 凝胶具有可调谐的硬度, 将其与宿主细胞一起播种, 然后感染病原体, 仍然包含一定的技术困难。然而, 我们预计, 在不久的将来, 我们将能够扩大目前的检测, 以研究感染的3D 设置。
综上所述, 所描述的协议连同初步的结果提供了证据表明, 这一新的检测可以成为一个非常有用的工具, 研究感染的黏附宿主细胞与致病细菌在数量的方式, 并在更生理相关的环境比以前检查。在所提出的装置中制备聚丙烯酰胺水凝胶的威力在于, 该方法与流式细胞术、染色后光镜、牵引力显微镜等多种技术的性能相适应。该方法可用于研究感染不同黏附宿主细胞类型的病原体, 我们预计将有重大影响, 以解开的策略, 其中病原体感染宿主和促进发展对感染的治疗干预。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 m. 页脚, r. Lamason, m. Rengaranjan, 以及 Theriot 实验室成员的讨论和实验支持。这项工作得到了 NIH 的 R01AI036929 (J.A.T.)、HHMI (J.A.T.)、HHMI 研究中心 (F.E.O.)、斯坦福大学研究生联谊会 (F.E.O.) 和美国心脏协会 (E.E.B.) 的支持。流式细胞术是在斯坦福共享的资产管制设施进行的。
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |