Summary

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

Published: May 01, 2018
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.

Abstract

Nachfrage für monoklonale Antikörper (MAK) in Grundlagenforschung und Medizin steigt jährlich. Hybridom-Technologie wurde die dominierende Methode für mAb Entwicklung seit seinen ersten Bericht im Jahr 1975. Als eine alternative Technologie sind Phagen-Display-Methoden für mAb Entwicklung zunehmend attraktiv, da Humira, der ersten Phagen abgeleitet Antikörper und eines der meistverkauften mAbs, für die klinische Behandlung der rheumatoiden Arthritis im Jahr 2002 genehmigt wurde. Als ein nicht-tierischen mAb Entwicklungstechnologie basiert, umgeht Phagen-Display Antigen Immunogenität, Humanisierung und tierischen Wartung, die von traditionellen Hybridom-Technologie basieren Antikörperentwicklung erforderlich sind. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Dieses Protokoll besteht aus: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Extraktion von Uracil-haltigen einzelsträngiger DNA (dU-SsDNA); (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt.

Introduction

mAbs haben breite Anwendungen von Grundlagenforschung bis hin zu Krankheit, Diagnostik und Therapie. Ab 2016 sind mehr als 60 mAbs durch die U.s. Food and Drug Administration (USFDA) für die klinische Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten1,2zugelassen.

Im Jahr 1975 berichtet, Kohler und Milstein, eine Technik für die kontinuierliche Erzeugung von Antikörpern eine einzelne klonalen Spezifität aus einer zellulären Quelle genannt “hybridome” und diese Technik später ein Eckstein in Medizin und Industrie3 geworden ist ,4. Generation von mAbs durch diese Methode erfordert verschiedene Schritte einschließlich Antigen Produktion, Maus Immunisierung, Gewinnung von B-Lymphozyten, Verschmelzung von B-Zellen mit Myelom-Zellen unsterblich Hybridoma Zellen, Klon-Auswahl, zu bilden und für therapeutische Anwendungen, Humanisierung ist erforderlich, um menschliche Anti-Maus-Antikörper (HAMA)4,5zu vermeiden. Für diese Technologie sind Antigene wie Toxine, Krankheitserreger und hoch konservierte Proteine jedoch relativ unwirksam bei der Auslösung einer Immunantwort in Vivo , mAb Produktion5.

Im Jahr 1978 berichtet Hutchison Et Al. die Verwendung von ein Oligonukleotid, direkte Mutagenese ein Rückstand in eine einsträngige Bakteriophagen Virus6. 1985 berichtete Smith, dass Fremd-gen-Fragmente können im Frame mit dem Gen Kodierung Phagen Hüllprotein III verschmolzen werden und somit auf der Phagen-Oberfläche angezeigt werden, können ohne seine Infektiosität7. Diese bahnbrechenden Werke einen Grundstein für den späteren Bau des Phagen angezeigt Antikörperbibliotheken in immun, naiv und synthetischen bildet mit den Formaten von Single-Chain Variable Fragment (ScFv) und Antigen-bindenen Fragment (Fab) für therapeutische mAb Development8,9. Aus technischer Sicht Phagen-Display-basierten Antikörper-Entwicklung bietet einen ergänzenden Ansatz für mAb Hybridom-basierte Entwicklung, die dazu beitragen kann, um die Beschränkungen zu umgehen, die einige Antigene darstellen können und die Humanisierung zu verarbeiten Hybridom abgeleitet Antikörper erfordern oft5. Ab 2016 6 Phage Display abgeleitet mAbs auf dem Markt, einschließlich Humira, eines der erfolgreichsten mAbs verwendet für die Behandlung der rheumatoiden Arthritis zugelassen und viele Phagen-Display abgeleitet Antikörper-Kandidaten befinden sich in verschiedenen Stadien der klinischen Untersuchung10.

Für immun- und naiv Phagen Antikörperbibliotheken, die Vielfalt der Komplementarität bestimmen Regionen (CDRs) in leichte und schwere Kette leitet sich aus dem natürlichen immun-Repertoire (d.h., von B-Zellen). Im Gegensatz dazu ist die Vielfalt der CDRs in synthetischen Phagen Antikörperbibliotheken völlig künstlich. Synthetische Ansätze zur Bibliotheksbau bieten präzise Kontrolle über das Design der Sequenz Vielfalt und bieten Möglichkeiten für mechanistische Studien der Antikörper-Struktur und Funktion11,12. Darüber hinaus kann der Rahmen für synthetische Bibliotheken vor Bibliotheksbau flussabwärts, groß angelegte industrielle Entwicklung11,12zu erleichtern optimiert werden.

1985, Kunkel berichtet einen einsträngige DNA (SsDNA) Template-basierte Mutagenese Ansatz effizient einzuführen Site-verwiesene Mutationen in Bakteriophage M1313. Dieser Ansatz wurde später für den Bau von Phagen angezeigt Bibliotheken verbreitet. Chemisch synthetisierten DNA Oligonucleotides entwickelt, um Vielfalt in Fab CDRs sind ein Phagemid mit einem Antikörper Rückgrat Template integriert. In diesem Prozess der Phagemid wird als ein Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) ausgedrückt und die Oligonucleotides sind geglüht auf die CDRs und erweitert, um doppelsträngige DNA (DsDNA) im Beisein von T7 DNA Polymerase und T4 DNA-Ligase zu synthetisieren. Schließlich kann generierte ds-DNA durch Elektroporation in Escherichia coli eingebracht werden.

Für hohe Diversität, Phagen angezeigt Bibliotheksbau, Hochspannungs-Elektroporation von einer zwei-Komponenten-Mischung aus Electro-kompetente Zellen und kovalent sollten geschlossene kreisförmige DsDNA (CCC-DsDNA) sorgfältig vorbereitet werden. Sidhu Et Al. modifiziert die Vorbereitung von Electro-kompetente Zellen und DNA von traditionellen Methoden und stark verbesserte Bibliothek Vielfalt14.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht der Bibliothek Bau einschließlich: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Gewinnung von dU-SsDNA; (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based ELISA zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt. Alle Reagenzien, Stämme und Ausrüstung sind in der Tabelle des Materialsaufgeführt. Tabelle 1 zeigt das Reagenz-Setup.

Protocol

Hinweis: Sterile Filterspitzen müssen im ganzen verwendet werden beim Umgang mit Phagen zur Vermeidung von Kontaminationen, Pipette Pistole und Umgebung. Aseptischen Bereich oder Haube muss beim Umgang mit Bakterien und Phagen Experimente verwendet werden. Phagen-Experiment-Bereich muss mit 2 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) gefolgt von 70 % igem Ethanol zur Vermeidung von Kontaminationen Phagen bereinigt werden. Für die Herstellung von Verdünnungsreihen in diesem Protokoll, sollten neue Tipps für jede Verdünnung verwe…

Representative Results

Nach dem Flussdiagramm der Fab Bibliotheksbau (siehe Abbildung 1), wir vorbereitet M13KO7 Helfer Phagen bereits infiziert E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen. Die Effizienz dieser Electro-kompetente Zellen wird als 2 X 109 KBE/µg geschätzt, wenn das Fab Phagemid Rückgrat für Bibliotheksbau verwendet wurde (Abbildung 4). Die Uracil Einbeziehun…

Discussion

Hohe Diversität, Phagen angezeigt Fab Bibliotheken, Qualitätskontrolle zu konstruieren sind Check-Points nötig, um verschiedene Phasen des Bauprozesses, einschließlich die Kompetenz der Elektro-kompetente Zellen, Qualität der Vorlage dU SsDNA, Effizienz der Überwachung CCC-DsDNA Synthese, Titer nach Elektroporation, Fab Falten und Aminosäure-Vielfalt der CDRs durch Sequenzanalyse der Fab-Phagen-Klone.

Hohe Ausbeute und Reinheit des dU-SsDNA ist wichtig für hohe Mutagenese Rate. Nach un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren schätzen Dr. Frederic Fellouse aus dem Sidhu Labor für kritische Anmerkungen auf Kunkels beruhende Methode synthetische Fab Phagen Bibliotheksbau. Die Autoren schätzen Frau Alevtina Pavlenco und weiteren Mitgliedern aus dem Sidhu Labor für wertvolle Hilfe von Hochleistungs-Elektro-kompetente Vorbereitung E. Coli Zellen und hochwertige dU-SsDNA. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006), DW und der ShanghaiTech Universität (Grant No.: F-0301-13-005) Labor der Antikörper Technik.

Materials

Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut  ung  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

References

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Cite This Article
Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

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