Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek
Summary
Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.
Abstract
Böcekler koku kaynakları doğru gezinme olanağı onların birinci dereceden koku reseptör nöronlar (ORNs) faaliyetleri üzerinde temel alır. Hatırı sayılır miktarda bilgi ile ilgili ORN yanıt odorants için oluşturulan, davranışsal yanıt sürüş belirli ORNs rolü kötü anlaşılır kalır. Bireysel ORNs, birden çok ORNs tek odorants ve koku uyaranlara kullanarak doğal olarak gözlenen zamansal değişimleri çoğaltılıyor zorluk tarafından aktive etkinleştirmek odorants farklı volatilities nedeniyle davranış analizlerde komplikasyonlar ortaya geleneksel koku-teslimat yöntemlerinin laboratuvarda. Burada, yanıt olarak kendi ORNs aynı anda optogenetic uyarılması Drosophila larva davranış analiz eder bir protokol açıklayın. Burada kullanılan optogenetic teknoloji ORN harekete geçirmek özgüllük ve ORN etkinleştirme zamansal kalıplarının hassas kontrol sağlar. Karşılık gelen larva hareketi izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel yazılım yazılı kullanılarak analiz. Koku uyaranlara ışık uyaranlara ile değiştirerek, bu yöntem için daha kesin bir denetim bireysel ORN etkinleştirme larva davranış üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir. Bizim yöntem daha fazla etkisi ikinci dereceden projeksiyon nöronların (PNs) yerel nöronlar (Ins) yanı sıra larva davranış çalışma için uzun olabilir. Nasıl koku nöron faaliyetleri tamamlayıcı çalışmalar içinde davranış yanıt-e doğru çevirmek ve bu yöntem böylece koku devre işlevi kapsamlı bir diseksiyon sağlayacak.
Introduction
Drosophila larva’nın ortamında koku bilgilerine yalnızca 21 işlevsel olarak farklı ORNs, faaliyetleri hangisini sonuçta larva davranış1,2,3,4belirlemek hissettim. Henüz, nispeten az hangi tarafından bu 21 ORNs faaliyetlerine duyusal bilgi kodlanmış mantığı hakkında bilinir. Böylece her larva ORN davranış için fonksiyonel katkılarıyla deneysel olarak ölçmek için gerek yoktur.
Drosophila larva ORNs tüm repertuar duyusal yanıt profilini ayrıntılı1,4,5, bireysel ORNs koku devre ve dolayısıyla katkılarıyla eğitim gördü, ancak gezinme davranışı büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Zorluklar larva davranış çalışmaları, şimdiye kadar dağınık şekilde ve geçici tek ORNs etkinleştirmek için yetersizlik nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Özellikle 19 21 Drosophila larva ORNs’harekete geçirmek odorants oluşan bir panel son zamanlarda açıklanan1idi. Her propil panelde, düşük konsantrasyonlarda, onun soydaş ORN sadece fizyolojik bir yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ancak, normalde geleneksel davranış deneyleri için kullanılan yüksek konsantrasyonları her propil birden çok ORNs1,5,6fizyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ayrıca, odorants Bu bölmedeki istikrarlı koku degradeler7,8oluşumu üzerinde bağlı davranış çalışmalar yorumlanması karmaşık hale volatilities çeşitli var. Son olarak, doğal olarak meydana gelen koku uyaranlara laboratuvar koşullarında çoğaltmak zordur zamansal bir bileşen var. Bu nedenle larva davranış aynı anda kayma ve zamansal bir şekilde tek tek ORNs etkinleştirilirken ölçebilen bir yöntem geliştirmek önemlidir.
Burada, yukarıda açıklanan larva izleme üzerinde avantajları vardır bir yöntem1,8deneyleri göstermektedir. Gershow ve ark. içinde açıklanan izleme tahlil elektronik kontrollü vanalar koku davranış arena8istikrarlı bir degrade korumak için kullanır. Ancak, karmaşık mühendislik koku uyarıcı kurulum oluşturmak ilgili düzeyi nedeniyle, bu yöntem diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Ayrıca, özellikle tek ORNs etkinleştirmek için odorants kullanılmasıyla ilgili konuları çözülmemiş kalır. Mathew vd içinde açıklanan izleme tahlil daha basit bir koku iletim sistemi kullanır, ancak ortaya çıkan koku degrade test propil volatilite bağlıdır ve tahlil1uzun süreler için kararsız. Böylece, koku bir çekim gücü ile hafif bir çekim gücü yerine, bizim yöntem özgüllük avantajları ve ORN etkinleştirme kesin zamansal bir denetim vardır ve farklı güçlü koku degradeler oluşumu üzerinde bağımlı değildir.
Bizim yöntem kurmak kolaydır ve araştırmacılar Drosophila larva gezinti yönlerini ölçme baktılar için uygundur. Araştırmacı kendi favori sistemin neuron(s) tercih CsChrimson ifadede sürücü yapabiliyor olması koşuluyla bu tekniği diğer sistemleri modellemek için adapte. CsChrimson kanal rhodopsin, kırmızı kaymıştır bir sürümüdür. Larva’nın fototaksis sisteme görünmez dalga boylarında, aktif. Biz bu nedenle nöronların özgüllük, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik9ile faaliyet manipüle edebiliyoruz. Özel yazılım konuların boyut değişiklikleri için hesap yazılı değiştirerek, bu yöntem kolayca gezinme larvaları diğer böcek türleri için adapte olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Drosophila larva davranış aynı anda optogenetic harekete geçirmek koku nöronların karşılık olarak ölçülmesi için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Daha önce açıklanan larva izleme yöntemleri1,8 farklı koku teslim teknolojisini kullanıyor ORNs harekete geçirmek. Ancak, bu yöntemleri özgüllük veya zamansal desenleri ORN etkinleştirme için kontrol edemiyorum. Bizim yöntem bu açıkları ORN harekete geçirmek daha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser University of Nevada, Reno fonlarından başlangıç ve Ulusal Sağlık Enstitüsü grant numarası P20 GM103650 altında NIGMS tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
