عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من المواقع الاستقرائي بما في ذلك البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية واستنزاف الليمفاوية المساريقي العلوي، ومواقع المستجيب بما في ذلك بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء المناعي الأمعاء الصغيرة.
Abstract
الجهاز المناعي المعوي تلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي عن طريق توليد استجابات متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal بينما تصاعد فعالية الاستجابات المناعية ل enteropathogenic الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، أنه أصبح من الواضح أن الحصانة المعوية المحلية تأثيراً عميقا على الحصانة البعيدة والجهازية. ولذلك، من المهم دراسة كيفية فعل استجابة مناعية معوية وما نتائج الاستجابة المناعية. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من مواقع الاستقرائي الأمعاء الدقيقة مثل البقع في بير الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية وتجفيف الغدد الليمفاوية المساريقي العلوي والمستجيب مثل بروبريا الصفيحة ظهارة الأمعاء. ويضمن هذا الأسلوب عزل عدد كبير من الخلايا الليمفاوية من أنسجة الأمعاء الصغيرة مع النقاء الأمثل والبقاء والحد الأدنى من التلوث يغلب المتبادل ضمن قيود زمنية مقبولة. القدرة التقنية على عزل الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى من الأنسجة المعوية يمكن فهم الاستجابات المناعية لالتهابات الجهاز الهضمي، وأمراض السرطان، وأمراض التهابات.
Introduction
الهضمي (غي) بالعديد من الطيات ونتوءات تمثل واجهة أكبر فصل الهيئة الداخلية والبيئة الخارجية. الأمعاء الجهاز المناعي يلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على وظيفة حاجز الجهاز الهضمي. استمرار تعرضه لمولدات المضادات الغذائية، commensal البكتيريا والجراثيم الممرضة. على هذا النحو، يجب أن تظل متسامح المستضدات الغذائية والبكتيريا commensal مع الحفاظ على القدرة على سرعة توليد استجابة مناعية فعالة للميكروبات انتيروباثوجينيك1. ويمكن تقسيم المناعي المعوية تشريحيا إلى مواقع الاستقرائي، حيث يتم تنشيط لمفاوية الساذج من مستضد تقديم الخلايا تحمل مستضدات من مخاطية الأمعاء، ومواقع المستجيب، حيث يمارس تنشيط الخلايا الليمفاوية المحددة وظائف المستجيب2. وتشمل المواقع الاستقرائي هيكل اللمفاوية المنظم بقع في بييير (PP) أن الدراسات الاستقصائية التجويف المعوي مباشرة من خلال عمل الخلايا M المتخصصة والإقليمية استنزاف المساريقي العلوي الليمفاوية (مليون). تتألف مواقع المستجيب بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية)، وهو النسيج الضام تحت الغشاء الطابق السفلي، وظهاره الأمعاء، طبقة وحيد خلية الموجودة أعلى الغشاء الطابق السفلي يحتوي على الخلايا الليمفاوية للسيتولوجيا (IEL). الخلايا الليمفاوية هي الجهات الفاعلة الرئيسية من مناعة التكيفية التوسط من أجل الحماية ضد الالتهابات والأمراض السرطانية وقد يسهم أيضا في إيمونوباثولوجي في أمراض التهابات. من المهم وذات صلة وثيقة بدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه متميزة المقصورات المخاطية تشريحية بشكل أفضل فهم وظائفها التعريفي والمستجيب.
ويلزم بروتوكول موحد وبسيط نسبيا لعزل الخلايا الليمفاوية من هذه المقصورات كما يتم التعجيل بعدد المحققين استكشاف محصنة ضد الأحداث التي تحدث في الأمعاء. مجموعات بحثية عديدة قد نشرت البروتوكولات التي تشترك في عدة عمليات مماثلة لعزل الخلايا المناعية من الماوس المقصورات الأمعاء الصغيرة3،4،،من56،7 . ومع ذلك، هناك العديد من الاختلافات التقنية فيما بينها تبعاً لتركيز البروتوكول الفردية. على سبيل المثال، مع التركيز على عزل الخلايا المناعية من ليرة لبنانية، وبروتوكول واحد يدرس أثر ديجيسشنز الانزيمية المختلفة على بقاء الخلية، الخلية السطحية علامة التعبير، وتكوين الخلايا المناعية معزولة5. بروتوكول آخر يسلط الضوء على طريقة سريعة واستنساخه لعزل الخلايا اللمفية دون كثافة استخدام الطرد المركزي6. وأخيراً، توجد بروتوكولات محددة أيضا غرض عزل البالعات وحيدات النوى من طبقات أنسجة مختلفة من الأمعاء الدقيقة7. ويرد هنا، استنساخه بشدة بروتوكول يسمح لعزل متسلسلة من السكان اللمفاويات من حجرة مليون PP، ليرة لبنانية و IEL من الأمعاء.
علينا أن نركز على عزل السكان عالية منقاة من المقصورات ليرة لبنانية و IEL، التي إلى حد كبير خالية من الملوثات من المقصورات المعوية الأخرى. وهذا يستخدم على نطاق واسع تنتج البروتوكول عائد عالية من الخلايا اللمفية أقصى نقية وقابلة للبقاء ضمن قيود وقت مقبول4،9،8،10،11،12. ويضمن هذا البروتوكول أيضا عزل الخلايا الليمفاوية من حجرة ليرة لبنانية و IEL مع الحد الأدنى من التلوث يغلب عبر، مما يتيح فرصة حسنة نية لدراسة الخلايا الليمفاوية في هذه المقصورات متميزة. لمفاوية معزولة يمكن أن تخضع للتلاعب أخرى مثل تدفق سيتوميتريك التحليل أو التحليل الوظيفي. هذا البروتوكول طبقت بنجاح إلى عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس الأمعاء والقولون خلال العدوى البكتيرية مثل الليستريه المستوحدة، typhimurium السالمونيلاو واليرسينيا بسيودوتوبيركولوسيس الإصابات والظروف الملتهبة مثل التهاب القولون الناجمة عن المواد الكيميائية والممرض. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لعزل الخلايا المناعية الفطرية مثل الخلايا الجذعية والضامة العَدلات وحيدات من الماوس الأمعاء الدقيقة والقولون.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الليمفاوية من الأمعاء المخاطية الاستقرائي (مليون و PP) ومواقع المستجيب (حجرة ليرة لبنانية و IEL). وقد وضعت البروتوكول لتحقيق التوازن بين المدخلات (الوقت) والمخرجات (الجدوى والعائد) تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية والنتائج. ويضمن البروتوكول أيضا تلوث مقسم عبر الحد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم قرارها منحة المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI076457) والأموال المقدمة من جامعة ستوني بروك. Z.Q. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
