Моноцитарных DC (MoDC) может смысле незначительных количествах опасности связанных молекул и поэтому легко загрунтовать. Мы предоставляем подробный протокол для изоляции MoDC от крови и опухоли и их активации с иммунных комплексов, подчеркнув основные меры предосторожности, которые следует рассмотреть, чтобы избежать их преждевременного активации.
Дендритные клетки (DC) являются гетерогенной клеточных популяций, которые отличаются в их маркеров клеточной мембраны, модели миграции и распределения и их презентации антигена и возможностей активации Т-клеток. Поскольку большинство прививок экспериментальной опухоли моделей требуют миллионы DC, они широко изолированы от костного мозга и селезенки. Однако эти DC значительно отличаются от крови и опухоли DC в их ответах иммунных комплексов (ИК) и, предположительно, другие Syk сочетании Лектин рецепторов. Важно, учитывая чувствительность DC опасность связанных молекул, присутствие эндотоксинов или антител, которые crosslink активацию рецепторов в одном из изоляции шагов может привести к грунтовки DC и таким образом влияют на параметры, или по крайней мере Дозировка, необходимых для их активации. Таким образом здесь мы опишем подробный протокол для изоляции MoDC из крови и опухоли, избегая их преждевременной активации. Кроме того протокол предусматривает MoDC активации с опухолью IC и их последующего анализа.
С момента их открытия дендритные клетки (DC) были в центре внимания обширных исследований из-за их уникальную способность наклонить Т клеточной дифференцировки1. За последние несколько десятилетий обширные исследования стремилась определить различные подмножества DC и их функции в ходе опухолевой прогрессии и иммунитет 2. РСУ состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые отличаются друг от друга в их распознавания рецепторов, распределение ткани, и далеко мигрирующих и антиген презентация возможностей3,4,5. По сравнению с другими DC подмножеств, моноцитарных DC (MoDC) являются гораздо более обильные в опухоли и могут быть легко получены из циркулирующих или опухоль проникновение моноцитов6,7. Таким образом многие клинические испытания, стремящихся воспользоваться их относительную распространенность основаны на in vivo и ex vivo манипуляции аутологичной MoDC для того, чтобы выявить Т-клеток иммунитета 8,9.
Аналогичным образом, DC-основе вакцинации экспериментальной опухоли моделей требует 2-3 последовательных инъекции, 5-7 дней врозь, 1-2 х 106 активированные DC пульсирующий с опухолевых антигенов. Таким образом, для достижения этого большое количество DC, большинство исследований мыши главным образом использовали MoDC культивировали из костного мозга (БМ) прекурсоров в ГМ-КСФ для 7-9 дней (Ил-4 не требуется в параметре мыши)10,11. Тем не менее учитывая что нокаут ГМ-КСФ у мышей в целом нормальное DC отсек 12,13и смешанным населением, полученные от этой культуры,14 физиологической значимости этих DC была поставлена под вопрос.
Кроме того DC может быть регулярно изолированы от клеток селезенки. Однако, DC составляют лишь около 0,3-0,8% всего селезенка клеток (в результате приблизительно 7 x 105 DC/селезенки) и эти клетки, только CD103+ DC и MoDC можно перенести обратно в лимфоидных органов. Поскольку MoDCs составляют примерно 10-15% населения15,селезеночной DC16, большинство протоколы изоляции дают примерно 1 х 105 MoDC в селезенке. Расширение MoDC может достигаться путем инъекций transfected клеток В16, которые выделяют ГМ-КСФ, что приводит к 100-кратного увеличения селезенки MoDC17. Однако, использование MoDC для разработки вакцин DC ограничен, поскольку эта процедура не может быть сделано в организме человека и полученные MoDC уже высоко активируются.
Помимо получения достаточного количества DC, еще один вызов для разработки эффективных DC вакцин против аутологичной раковых клеток предполагает отсутствие достаточных сигналы опасности в параметре опухоль полностью активировать DC. Индукции co-stimulatory сигналов обычно достигается путем активации распознавания рецепторов (ПРР), или тип c Лектин сигнальных путей18,19,20,21. Еще один подход для активации DC эксплуатирует их способности принимать антигены путем взаимодействия с поверхности Fcγ рецепторы (FcγR). Действительно, ряд важных рукописей показали, что инъекции MoDC от БМ прекурсоров, активированный с опухоль IgG IC может предотвратить рост опухоли в профилактической настройки и может привести к ликвидации установленных опухоли22,23 .
В двух последних документах Карми et al. обнаружил, что в отличие от BMDC и селезенке DC, MoDC из крови и опухоли не может реагировать IgG IC без дополнительных стимулов. Это было признано благодаря наличию внутриклеточного уровня тирозин фосфатаз, регулирующие FcγR сигнализации24,25. Определение критических контрольных точек в DC, эта работа представил важное понимание требований для успешной вакцинации на базе DC. Потребность в дополнительных стимулов для включения FcγR сигнализацию и предположительно сигнализации от других рецепторов Лектин, используя аналогичные фосфорилирование Каскад, таким образом подчеркивает необходимость избегать грунтование DC во время их изоляции.
Таким образом настоящий Протокол описывает изоляции MoDC от крови и опухоли, которые заметно отличаются от БМ и селезенке DC, и освещаются меры предосторожности стоит рассмотреть во время процесса.
Учитывая большое количество DC, необходимых для вакцинации мышей (около 2-4 x 106 DC за одну мышь), большая часть стратегии в мышах основаны на изоляции DC от БМ и селезенки, следуют их активации ex vivo вакцинации. Однако попытки активировать опухоли DC в естественных условиях, испо…
The authors have nothing to disclose.
Нет
Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |