慢性的な痛みの治療に遺伝子組換えタンパク質の開発
Summary
本稿で生産の方法と IL4 10 融合組換えタンパク質の品質管理のための詳細を提供します。また炎症性疼痛モデルマウスの痛みを解決するには、このタンパク質の有効性をテストする方法を示します。
Abstract
慢性的な痛みは治療が困難、持続的な痛みを解決への新しいアプローチが急務します。抗炎症性サイトカインは、衰弱させる痛みの原因異常神経免疫の相互作用を調整するための能力を扱う有望な候補です。生理学的、彼らは様々 なサイトカインのネットワークで動作し、したがってその治療効果がスタンドアロンの薬として使用する場合に最適なできない場合があります。この制限を克服する、抗炎症性サイトカイン IL4、IL10 の融合タンパク質を開発しました。ここでは、生産と IL4 10 融合組換えタンパク質の品質管理法について述べるし、我々 は永続的な炎症性疼痛モデルマウスの痛みを解決する IL4 10 融合タンパク質の有効性をテストします。
Introduction
慢性的な痛みのまま最も衰弱や下処理、21 世紀医療の問題の 1 つに影響を与える > 成人1,2の 20%。しかし、慢性的な痛みからの救済を提供するために治療はしばしば効果がないまたは重篤な副作用3を中止する必要があります。重要なは、現在使用可能な薬品だけ徴候の救助を提供するが、大幅変更か慢性的な痛みを治します。慢性的な痛みは、神経疾患に見えますが、慢性的な痛み開発4,5における免疫系の関与が示唆されました。また、痛みを治療する免疫ベースのアプローチを浮上しています。たとえば、抗炎症性サイトカインは慢性的な痛み6,7,8のいくつかのモデルで痛みを抑制します。しかし、抗炎症性サイトカインは半減期が短い、その潜在的な痛み抑制効果を減らすことにあります。さらに、抗炎症性サイトカインは互いに連携で最も最適に動作します。これらの制限を克服するために我々 最近に融合させた抗炎症性サイトカイン インターロイキン 4 (IL4) およびインターロイキン-10 (IL10) 1 つの分子。IL4 10 融合タンパク質は、個々 サイトカイン9と比較して慢性の炎症や神経因性疼痛を抑制することで優れた効果を示しています。ここで述べるような融合蛋白質の生成方法精製し、その品質を制御する方法。
IL4 10 融合タンパク質細胞 HEK293 F 細胞のトランスフェクション IL4 10 融合蛋白質を符号化する cDNA シーケンスを運ぶ pUPE 発現ベクターと生産されています。F HEK293 細胞は細菌の表現システムでは発生しません何か蛋白質の翻訳後修飾を許可するように選択されます。糖鎖のシアル酸、β-ガラクトシド-2 を符号化する cDNA の上限を最適化するには、3-シアリル-トランスフェラーゼは 2 番目の遺伝子としてベクターに組み込まれます。融合タンパク質精製精製よりも強力であるために、培養上清中の親和性蛋白質の浄化を使用他の方法例えばサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィー10,11。IL4 10 融合蛋白質を浄化するには、IL4 に対する社内の作ったモノクローナル抗体を使用しました。純度の評価と精製 IL4 10 融合タンパク質の活性は、品質管理の一部として実行されます。生産バッチの純度は、ナトリウム Dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と高圧サイズ排除クロマトグラフィー (HP 秒) によって評価されます。IL4 10 融合タンパク質の活性がリポ多糖 (LPS) を阻害する能力を測定することによって評価される-全血文化、腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) 生産誘発効果し、比較して個々 の組み合わせにサイトカイン。
最後に、慢性的な痛みを抑制する IL4 10 融合蛋白質の能力をテストするために持続的な炎症性の痛み12,13,14 の広く使用されているマウス ・ モデルには鎮痛剤としての融合蛋白質のテスト方法について述べる.ここで我々 は、炎症性疼痛モデルの方法を説明します。ただし、痛みの他のモデルに使用される (例えば、神経因性疼痛モデル) することができます研究によって質問に回答する必要があることに注意することが重要です。これらのモデルの痛みを評価するために誘発を含む行動対策や非誘発疼痛対策のさまざまな使用することが重要です。ここでは、機械的および熱的誘発行動応答の変化のための評価方法について述べる。無害な刺激への機械的感度は、ハーグリーブス テストを使用して温度感受性を評価しながら Von Frey テストを使用して評価されます。重要なは、非誘発痛覚過敏/アロディニアは、動的重量軸受テストを使用して測定されます。これらの措置の疼痛対策として広く受け入れられて、痛みのしきい値と動物15,16,17によって経験される潜在的な疼痛に関する重要な情報をもたらします。他の非誘発などの痛み (例えば、独立した刺激)、エアコンの場所の好みテストを評価するための措置、貴重な18があります。痛みを抑制する薬の可能性を評価するためには痛みの領域に到達し、全身 (サイド) 効果19を避けるために必要な以下の蛋白量管理のこのルート融合タンパク質の髄腔内投与を我々 実行 20。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、生産及び組換え IL4 10 融合タンパク質のキャラクタリゼーションの方法と永続的な炎症性疼痛のマウス ・ モデルにおける炎症性痛覚過敏を抑制することでその有効性をテストする方法について説明します。生産と IL4 10 融合タンパク質の精製は、小規模で実行されます。HEK293 細胞は、原核生物の発現系で達成することはできませんポスト翻訳の修正ができるので生産タンパク…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品の一部は、ユトレヒト大学生命科学によって賄われている付与
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
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