Summary

Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока

Published: March 23, 2018
doi:

Summary

Полуавтоматические рабочего процесса представлен целевой последовательности 16S рРНК от материнского молока и других видов биомассы температура образца.

Abstract

Исследования микробных сообществ стали широко с развитием виртуализации сравнительно недорогой, быстрый и высокой пропускной способности. Однако как с всеми этими технологиями, воспроизводимые результаты зависят от лаборатории рабочий процесс, который включает в себя надлежащие меры предосторожности и контроля. Это особенно важно с низким биомассы образцов, где заражения бактериальной ДНК может генерировать заблуждение результаты. Эта статья подробно описывает полу автоматизированный рабочий процесс для идентификации микробов из образцов молока груди человека с помощью целенаправленных последовательности региона V4 16S рибосомная РНК (рРНК) низкого и среднего throughput масштабе. Протокол описывает пробоподготовки от цельного молока в том числе: образца лизиса, извлечения нуклеиновой кислоты, усиление V4 региона гена 16S рРНК, и библиотека с мерами контроля качества. Важно отметить, что протокол и обсуждения рассмотреть вопросы, которые характерных для подготовки и анализа образцов низкой биомассы, включая соответствующие позитивные и негативные элементы, ПЦР ингибитор удаления, пример загрязнения окружающей среды, реагент, или экспериментальных источников и экспериментальной наилучшей практики, призванные обеспечить воспроизводимость. В то время как протокол, как описано для образцов человеческого молока, он адаптируется к многочисленные типы биомассы низкого и высокого образца, включая пробы на палочки, замороженные аккуратные, или стабилизации в буфере сохранения.

Introduction

Считается, что микробных сообществ, которые колонизировали людей являются критически важным для здоровья человека и болезнь влияющих на метаболизм, иммунных развития, восприимчивость к болезням и ответы на вакцинацию и наркотики терапия1, 2. подчеркнуть усилия, чтобы понять влияние микробиоты на здоровье человека в настоящее время идентификации микробов, связанные с определенными анатомическими отсеков (т.е., кожи, кишечника, Оральный секс, и т.д.), а также локализованные сайты в рамках Эти отсеки3,4. Лежащие в основе этих следственных усилий является быстрое появление и увеличение доступности технологий следующего поколения последовательности (НГС), которые предоставляют массивно параллельной платформу для анализа содержания микробных генетических (микрофлора) образца. Для многих физиологических образцы, связанные микрофлора комплекс и обильные (то есть, стул), но для некоторых образцов, микрофлора представлена низкими микробной биомассы (то есть, человеческое молоко, нижних дыхательных путей) где чувствительность, экспериментальных артефактов и возможного загрязнения становятся основным вопросам. Общие проблемы исследований микрофлора и соответствующий экспериментальный дизайн были предметом нескольких обзор статей5,6,,78.

Представленные здесь надежные экспериментальные трубопровода NGS основан на целевые последовательности рРНК 16S V4 региона9 характеризовать микрофлора грудного молока. Анализ микрофлора грудного молока сложен не только низких микробной биомассы10, но дополнительно высокий уровень ДНК человека фон11,12,13,14 и потенциальные уноса ПЦР ингибиторы15,16 в извлеченной нуклеиновых кислот. Этот протокол основывается на коммерчески доступных извлечения наборы и полуавтоматические платформ, которые могут помочь свести к минимуму колебаний через образец подготовки пакетов. Она включает в себя четко определенных бактериальных макет сообщество, которое обрабатывается вместе с образцами, как контроль качества проверяет каждый шаг в протоколе и обеспечить независимый метрики надежности трубопроводов. Хотя протокол как описано специфичен для образцов материнского молока, он легко адаптируется для других образцов типов включая стула, ректальные, вагинальные, кожи, рыхлой и устные тампоны10,17и может служить отправной точкой для Исследователи, которые желают выполнять анализ микрофлора.

Protocol

Для всех шагов протокол должны носить надлежащего средства индивидуальной защиты (СИЗ), и подходы к профилактике строгие загрязнения должны быть приняты. Наблюдать поток работ от предварительного усиления работы после усиления работы районы для сведения к минимуму загрязнения образц…

Representative Results

Представленные здесь протокол включает важные контроля качества (КК) меры для обеспечения что встречаются данные критерии для протокола управления чувствительность, специфичность и загрязнения. Протокол первого шага КК следует амплификации PCR 16S V4 региона (<strong class="xfi…

Discussion

Целевые секвенирование нового поколения 16S рРНК методика широко используется, быстрое микрофлора характеристика18. Однако многие факторы, включая пакет эффектов, загрязнение окружающей среды, пример перекрестного загрязнения, чувствительность и воспроизводимости может ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Helty Adisetiyo, PhD и Ян Shangxin, PhD для развития протокола. Общая поддержка для международного материнской педиатрических подростков СПИДа клинических испытаний группы (IMPAACT) была представлена в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) из национальных институтов здравоохранения (НИЗ) под номерами премии UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) и UM1AI106716 (IMPAACT LC), при совместном финансировании от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека (NICHD) и Национальный институт психического здоровья (NIMH). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Materials

AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant 
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer 
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol  Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen  79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
 96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation  Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit  Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq    Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)

Play Video

Cite This Article
Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

View Video