Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt
Summary
Hier presenteren we een protocol ter verhoging van de productie van de chimera zonder het gebruik van nieuwe apparatuur. Een verandering van de eenvoudige oriëntatie van het embryo voor injectie kan verhogen van het aantal embryo’s geproduceerd, en potentieel het reduceren van de tijdlijn tot germline transmissie.
Abstract
In een poging om het verhogen van de efficiëntie in het creëren van genetisch gemodificeerde muizen via ES cel methodologieën, presenteren wij een aanpassing van het huidige protocol van de injectie van de blastocyst. Wij rapporteren hier dat een eenvoudige rotatie van het embryo, en injectie via Trans-Inner cell mass (TICM) steeg het percentage chimeer muizen van 31% tot 50%, zonder extra apparatuur of verdere gespecialiseerde opleiding. 26 verschillende inteelt klonen, en 35 totaal klonen werden ingespoten over een periode van 9 maanden. Er was geen significant verschil in ofwel zwangerschap tarief of herstel van embryo’s tussen traditionele injectie technieken en TICM. Dus, zonder elke belangrijke wijziging in het proces van injectie en een eenvoudige plaatsing van de blastocyst en injecteren via de ICM, het vrijgeven van de ES-cellen in de holte van de blastocoel kan potentieel verbeteren de hoeveelheid chimeer productie en daaropvolgende germline transmissie.
Introduction
De oprichting van genetisch gerichte muizen is al bijna 25 jaar, een langzaam proces, vaak belemmerd door een knelpunt in het blastocysten ES cel microinjection stadium voor de generatie van germline Chimaera overbrengen. Recente ontwikkelingen, waaronder CRISPR/Cas91,2 in ES-cellen en high-throughput ES targeting generatie consortia zoals GECOMP cel, de generatie/beschikbaarheid van de genetisch gemodificeerde ES-cellen hebben verbeterd. De generatie van germline Chimaera blijft echter een knelpunt in het creëren van genetisch gemodificeerde muizen van deze ES cellen3,4. High-throughput ES cel generatie projecten hebben geteisterd door hoge variabiliteit in ES cel kwaliteit, die is van cruciaal belang voor succesvolle creatie van germline Chimaera. Bovendien zijn enkele van de algemeen gebruikte ES-cellijnen gekend voor hoge aneuploïdie en moeilijk productie van germline bevoegde Chimaera5.
Veel methoden zijn ontwikkeld om muizen te maken met ofwel een hogere hersenschim, of volledig ES cel afgeleid muizen6,7,8,9,10. Terwijl elk van deze systemen zijn eigen merites heeft, hebben ze ook hun tekortkomingen. De generatie van tetraploïde Chimaera, terwijl de muizen, het genereren van 100% ES cel afgeleid is inefficiënt en over het algemeen beperkt tot outbred lijnen 5,6. Nieuwere methoden voor het injecteren van de morula kunnen opleveren hoog percentage Chimaera, bijna 100%, maar over het algemeen vereisen aanzienlijke extra apparatuur (lasers of piezos) en opleiding10,11. In laboratoria waar deze technieken reeds op zijn plaats zijn, kan deze nieuwe methodologie niet nodig zijn.
Doel van deze studie was het vinden van een methode die gemeenschappelijke technieken en gemakkelijk verkrijgbare apparatuur wordt gebruikt om het tempo van de chimera generatie, verhogen de kans op germline transmissie van de mutant allel vast te stellen van de daaropvolgende muis kolonie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is lang gedacht dat verstoringen van de ICM zou kunnen tot sterfte, in feite leiden, huidige blastocyst microinjection protocollen nog waarschuwen voor dit12,13. Wat we hier hebben aangetoond is dat microinjection via de ICM is niet schadelijk is voor het embryo en verhoogt het rendement van chimaera.
Het exacte mechanisme voor dit effect niet geïdentificeerd. Echter moet de mechanische verstoring van de ICM, en de bijbehorende hy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd [deels] gesteund door de intramurale Research Program van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Speciale dank aan Shyamal Peddada voor statistische analyse. Wij willen ook Humphrey Yao, Gary Bird en Yuki Arao bedanken voor de herziening van dit manuscript, en Franco DeMayo voor zijn niet aflatende steun en advies.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
