Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.
Un número creciente de técnicas de microscopía de superresolución está ayudando a descubrir los mecanismos que rigen el mundo celular de nanoescala. Proyección de imagen de una sola molécula está ganando impulso, ya que proporciona un acceso excepcional a la visualización de moléculas individuales en células vivas. Aquí, describimos una técnica que desarrollamos para realizar seguimiento de la solo-partícula microscopía de localización foto-activado (sptPALM) en larvas de Drosophila . Comunicación sináptica depende de la claves proteínas presinápticas que actúan por acoplamiento, cebado y promoviendo la fusión de la que contiene el neurotransmisor las vesículas con la membrana plasmática. Una gama de interacciones proteína-proteína y proteína-lípido regula firmemente estos procesos y las proteínas presinápticas por lo tanto exhiben cambios en la movilidad asociada a cada uno de estos eventos claves. Investigar cómo la movilidad de estas proteínas se correlaciona con su función fisiológica en un animal vivo intacto es esencial para comprender su mecanismo exacto de acción. Extracción de movilidad de la proteína con alta resolución en vivo requiere superar limitaciones tales como la transparencia óptica, la accesibilidad y la profundidad de la penetración. Describimos cómo photoconvertible proteínas fluorescentes etiquetadas a la proteína presináptica sintaxina 1A puede ser visualizado mediante leve iluminación oblicua y seguimiento en la terminal del nervio motor o a lo largo del axón de la neurona de motor de la tercera instar Drosophila larva.
La comunicación neuronal se basa en la liberación del neurotransmisor, que se produce a través de la fusión regulada de neurotransmisor que contienen vesículas sinápticas con la membrana plasmática1. Este proceso llamado exocitosis2,3,4,5,6 es altamente dinámico y puede ser regulado de arriba o abajo según las fluctuaciones de la tasa de estimulación7. Las proteínas implicadas en estos procesos están sujetos a movimiento browniano y por lo tanto Mostrar nanoscópicas organización capaz de sostener una serie de enlace acciones que apuntalan estas funciones fisiológicas. Las proteínas de la membrana plasmática son altamente dinámicas, permitiendo captura lateral de las moléculas en nanoclusters en la membrana del plasma7,8,9,10,11, 12. Por lo tanto, investigar la movilidad de estas proteínas ayuda a aclarar su modo de acción8. Proteínas sinápticas como las N-etilmaleimida sensible factor accesorio proteínas receptores solubles (trampas), por ejemplo sintaxina-1A, ahora se sabe que exhiben movilidad lateral rápido, así como la lateral reventado dentro de nanoclusters que pueden servir como molecular depósitos y sitios de vesícula fusión9,13,14,15.
El desarrollo reciente de las proteínas fluorescentes photoconvertible, como monómero (m) Eos16,17 y18de Kaede, ha permitido la resolución nanoscópicas de proteínas de la membrana plasmática neuronal mediante el uso de enfoques tan como microscopía de localización foto-activado (PALM) y estocástico reconstrucción óptica microscopia (tormenta)14,15,19. Estos desarrollos han permitido que las investigaciones sobre la movilidad y la nanoclustering de proteínas biológicas en células vivas cultivadas y las neuronas. Más recientemente, han se han realizado estudios para aclarar (en altas resoluciones similares) la dinámica y organización de estas proteínas de membrana en las neuronas de organismos vivos intactos tal Mus musculus, Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Investigación de la dinámica y organización de una proteína en vivo requiere no sólo el uso de las herramientas de imagen resolución súper desarrollados recientemente (tales como fluoróforos Palma, tormenta y photoconvertible), pero también la capacidad para superar obstáculos tales como la accesibilidad de la proteína y la profundidad de penetración del láser de proyección de imagen. Imágenes de proteínas intracelulares en un animal intacto es inherentemente difícil como es la proyección de imagen proteínas en estructuras profundamente encajadas los tejidos vivos del animal intacto, como el hipocampo de un ratón intacto. Por lo tanto, más fácilmente se reflejada proteínas en o cerca de la superficie del tejido. Otra dificultad con la proyección de imagen en vivo es para garantizar la reproducibilidad a través de animales. Como la anatomía puede diferir de una muestra a otra, seleccionar una estructura con facilidad de replicación en diferentes muestras de animales intactas también podría desafiar. El uso de estructuras estereotipadas, tales como sinapsis, ayudar a superar algunas de estas dificultades.
Estudios recientes han reflejado movilidad de la proteína en los animales con una epidermis ópticamente transparente como Caenorhabditis elegans22, mientras que otras investigaciones han reflejado la organización de proteínas en la superficie de un tejido/órgano, por ejemplo proyección de imagen de actina en las neuronas corticales a través del cráneo de un ratón vivo21. En algunos casos, se han utilizado anestésicos para mantener el animal inmóvil; sin embargo, anestésicos específicos pueden afectar adversamente la proteína de interés. Medios alternativos para mantener animales inmóviles durante proyección de imagen en vivo por lo tanto deberían estudiarse para minimizar el error.
Otra advertencia a super-resolución imágenes en vivo es que el láser utilizado para iluminar las proteínas de interés que podía afectar el tejido circundante, y por lo tanto, mantener la intensidad de excitación tan bajo como sea posible se recomienda. Iluminación de los tejidos circundantes por el láser también tiende a aumentar la señal de fondo. El uso de la intensidad de excitación baja ayuda a reducir el fondo, la salvedad de que él también podría conducir a una disminución en el rendimiento de proteína fluorescente del fotón. Sustracción de fondo durante el análisis podría ser utilizado como una alternativa reducir la señal de fondo antes de análisis de imagen.
Drosophila presenta un organismo ideal para en vivo la proyección de imagen ya que proporciona herramientas genéticas bien establecidas para la investigación de la función de la proteína específica. La secuencia de activación ascendente (UAS)-sistema de Gal4 permite expresión temporal y espacial de las proteínas y por lo tanto puede utilizarse para manipular la neurotransmisión23, que estimulación termo genético utilizando Drosophila transitoria Subfamilia potencial receptor A1 (dTRPA1)24 o estimulación opto-genética usando far-rojos-cambiado de puesto CsChrimson25 puede combinarse con la proyección de imagen14. Han superado muchas de las complicaciones de llevar a cabo en vivo imágenes de una sola molécula en este sistema y ahora describir cómo rastreo de partículas solo pueden realizarse en melanogaster del Drosophila larvas de tercer estadio.
Este protocolo describe el seguimiento de una sola molécula de proteínas mEos2-etiquetado en la Unión neuromuscular de la Drosophila tercer instar larva. Para evitar la sobre expresión de la proteína transgénica, sintaxina-1A-mEos2 expresión fue impulsado por endógeno promotor de la sintaxina 1A. Estudios de movilidad de la proteína sináptica han sido limitados a las investigaciones en vitro de cultivos de células y neuronas corticales9,11,12,13. Si estas proteínas exhiben firmas similares de movilidad en un animal vivo es en gran parte desconocido. Para visualizar solo proteína movilidad en vivo, limitaciones tales como la profundidad óptica de la transparencia, la accesibilidad y la penetración tienen que ser superado. Por disección la preparación larvas y visualizar las uniones neuromusculares encajadas la superficie del músculo, evitamos el tema de la transparencia óptica y la accesibilidad. Intentos de movilidad de una sola molécula de imagen en la configuración normal de la TIRF probaron fracasados. Sin embargo, el uso de iluminación ligeramente oblicua permite láser de excitación mayor profundidad de penetración. Además, los pernos de minutien usados para inmovilizar, la larva ha ayudado a evitar cualquier posible efecto adverso de uso anestésico sobre la movilidad de la proteína. Es posible utilizar objetivos de aumento mayor, como 100 x objetivos de inmersión de aceite, para visualizar las moléculas individuales en vivo. Sin embargo, mayor ampliación puede aumentar la ocurrencia de desvíos de la deriva fuera de foco. Además, hemos utilizado una intensidad más baja (~ 30%) 561 nm láser con éxito a las moléculas individuales de la imagen en las terminales del nervio motor. Pruebas adicionales se requiera utilizar menor energía del laser.
Este protocolo es conveniente visualizar la movilidad de las proteínas sinápticas en las cercanías de la membrana plasmática neuronal. Usando este enfoque, la movilidad de la proteína SNARE – sintaxina 1A y el autophagosome obligado proteína Atg18a – han sido correctamente reflejada en vivo14,26. La movilidad de las proteínas en motoneurona axones también pueden ser investigado27. Sin embargo, la investigación de la movilidad de las proteínas en el cerebro o cordón nervioso ventral puede resultar difícil de evaluar debido a la señal de la euforia producida por el tejido subyacente; Además, visualizar la movilidad de la proteína en la misma estructura cerebral requerirá etiquetado fluorescente la estructura del cerebro (para asegurar la replicabilidad), y se necesitaría el uso de la proyección de imagen de doble cámara.
Métodos actuales disponibles para la microscopía de superresolución en Drosophila en su mayoría se limitan a imágenes de embriones, en lugar de los más desarrollados tercer instar de la larva38,39. El problema principal con estos protocolos es que producen un bajo número de trayectorias en el área de imagen y por lo tanto evitar el análisis en profundidad de movilidad Estados22,40. Nuestra en vivo sola molécula seguimiento protocolo tiene la capacidad de generar un gran número de trayectorias y por lo tanto podría ser utilizada en otros modelos animales como Caenorhabiditis elegans y pez cebra. De hecho, cada cadena NMJ genera trayectorias de 2.400 ~ lo que es adecuado para el análisis de los diferentes Estados móviles y las transiciones entre estos Estados14,27. Además, muchos en vivo sola molécula imagen estrategias se basan en el uso de anestésicos para inmovilizar los animales20,22, que podría alterar la función fisiológica que se realiza la proyección de imagen. Aquí hemos optimizado un protocolo ‘sin anestesia’ para inmovilizar las larvas con pernos minutien.
Un potencial uso de este protocolo puede ser para la visualización de la movilidad de las proteínas en tres dimensiones. Los recientes avances en la microscopía de superresolución permiten movilidad de la proteína ser visualizado en vitro en ‘x’, ‘y’ y ‘z’ dimensiones41,42. Nuestro método actual no tiene en cuenta la movilidad de las proteínas en el eje ‘z’. Sin embargo, el nervio motor del Drosophila terminal es una estructura esférica y un valioso enfoque futuro será cuantificar la movilidad de la proteína en un volumen tridimensional43. Proyección de imagen en la dimensión z es factible utilizando una lente astigmática. Por otra parte, en el TIRF modo44,45, z-resolución también aumenta. Sin embargo, en nuestros experimentos, hemos utilizado iluminación ligeramente oblicua para visualizar las moléculas individuales de syntaxin1A-mEos2 sin la lente astigmática.
En conclusión, la disponibilidad de ambos un transgénico Drosophila mosca stock expresando proteínas etiquetadas con una proteína de photoconvertible, una base de PDMS para disecar la larva transgénica, así como un microscopio TIRF equipada con la posibilidad de cambiar la ángulo de iluminación son las más importantes herramientas necesarias para visualizar proteínas individuales como se describe en este protocolo.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Jean-Baptiste Sibarita y Daniel Choquet (IINS, CNRS y la Universidad de Burdeos) por su apoyo con el análisis de una sola molécula. Agradecemos especialmente a Nick Valmas y Jessica Mcgaw (QBI, Universidad de Queensland) para su ayuda con el video grabación, voz en OFF, así como diseño gráfico de la figura. Este trabajo fue financiado por el proyecto de descubrimiento de Consejo de investigación australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), la Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), beca del futuro (FT100100725 a B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M). y proyecto de NHMRC (APP1103923 a B.V.S.). F.A.M. es NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).
PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |