ويصف هذا البروتوكول إجراء تقييم الحيوانات المنوية الأسماك باستخدام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب وأجهزة التبريد. ويعطي البرنامج السريع، دقيقة، والتحليل الكمي لجودة الحيوانات المنوية الأسماك استناداً إلى حركية المني، التي يمكن أن تكون أداة مفيدة في تربية الأحياء المائية في تحسين نجاح الاستنساخ.
لتقييم نوعية مشيج، هناك تقنيات مبتكرة وسريعة، والكمية التي يمكن أن توفر بيانات مفيدة لتربية الأحياء المائية. ووضعت النظم المحوسبة لتحليل الحيوانات المنوية لقياس العديد من المعلمات وواحد لقياس الأكثر شيوعاً هو عدد الحيوانات المنوية الحركة.
في البداية، صمم هذا تكنولوجيا الحاسوب لأنواع الثدييات، على الرغم من أنه يمكن استخدامها أيضا لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. الأسماك لها السمات المحددة التي يمكن أن تؤثر على الحيوانات المنوية التقييم مثل فترة زمنية قصيرة حركية بعد التنشيط، وفي بعض الحالات، التكيف مع انخفاض درجات الحرارة. وبالتالي، من الضروري تعديل مكونات البرامج والأجهزة لجعل تحليل حركية أكثر كفاءة لتحليل الحيوانات المنوية الأسماك. للثدييات من الحيوانات المنوية، يتم استخدام لوحة التدفئة للحفاظ على درجات الحرارة المثلى للمني. ومع ذلك، لبعض أنواع الأسماك، أنها مفيدة لاستخدام درجة حرارة أقل لإطالة فترة حركية، نظراً للحيوانات المنوية تبقى نشطة لأقل من 2 دقيقة. ولذلك، أجهزة التبريد ضرورية للثلاجة العينات في درجة حرارة ثابتة على مر الزمن التحليل، بما في ذلك في المجهر الضوئي. ويصف هذا البروتوكول تحليل عدد الأسماك الحيوانات المنوية الحركة باستخدام البرمجيات لتحليل الحيوانات المنوية وتبريد جديدة من الأجهزة تحسين النتائج.
فعالية الاستنساخ يعتمد على نوعية كل الأمشاج (البيض والحيوانات المنوية)1،2. وهذا هو العامل الرئيسي الذي يسهم في نجاح الإخصاب، مما يتيح وضع ذرية صالحة3،4. تقييم جودة مشيج مريحة هو أفضل أداة لتحديد إمكانات الخصوبة من عينة.
خلط الحيوانات المنوية من الذكور متعددة ممارسة شائعة في إنتاج العديد من الأنواع التجارية المائية4. بيد أن تنوع الحيوانات المنوية بين الذكور يمكن أن يؤدي إلى المنافسة الحيوانات المنوية ونتيجة لذلك، ليس جميع الذكور على قدم المساواة تساهم الجينات5. وبهذا المعني، التقييم الصحيح لميزات السائل المنوي/المني الفردية، مثل حركية، أمر أساسي للحصول على معلومات تمييزية فيما يتعلق بخصوبة الذكور الفردية المحتملة. الملاحظة المباشرة لعدد الحيوانات المنوية الحركة يمكن أن تنتج بيانات غير دقيقة وغير موضوعية كما أنه يتطلب الوقت والخبرة، مما يؤدي إلى عدم الاتساق وعدم التوافق بين نتائج6،7. ومع ذلك، هناك العديد من تقنيات مبتكرة وسريعة والكمية التي يمكن أن توفر الحيوانات المنوية موثوقة نوعية تحليل2،4.
تم تطوير تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب لتقديم بيانات دقيقة عن نوعية الحيوانات المنوية8. وتشمل هذه التكنولوجيا تطوير البرمجيات المرتبطة مجهر تباين المرحلة التي تسمح تقييم لعدد الحيوانات المنوية الحركة. ومع ذلك، هو عاملاً يحد من المعلمة حركية معدل الإطار لكاميرا الفيديو. المني كل المني والمسارات تستند رئيس الموقف centroid في إطارات متتالية من تسجيلات الفيديو، الذي يرتبط بحركة flagellar أنماط3،،من910، 11. هي المعلمات الحركية الرئيسية قياس سرعة الخط المستقيم (VSL) والمنحنية الخطوط السرعة (VCL) ومسار متوسط السرعة (برنامج عمل فيينتيان). VSL هو المسافة بين نقطة البداية ونقطة النهاية التي اتخذتها المني مقسوماً على وقت. VCL هي السرعة الحقيقية على طول المسار الدقيق اتخذتها المني. هو برنامج عمل فيينتيان سرعة على طول طريق ممهدة مشتقة من المسار. تسمح هذه المعلمات معلومات حركية إضافية، بما في ذلك الخطي (لين) والاستقامة (STR) وتمايل (وب) وقياسات الضرب مثل السعة لحركة الرأس الأفقي (آلة) والتردد عبر فوز (معامل التركيز الأحيائي)4،10.
كانت في الأصل تستخدم نظام تحليل الحيوانات المنوية لأنواع الثدييات، ومن متطلبات النظام تعمل في درجة حرارة الجسم للجهة المانحة (حوالي 37 درجة مئوية). يمكن أيضا استخدام هذا البرنامج للأنواع السمكية؛ على الرغم من ذلك، من الضروري إجراء بعض التعديلات لتقليل الخطأ في نتائج تحليل الحيوانات المنوية. في بعض أنواع الأسماك، مثل السلمون وثعبان البحر8،12، يحدث الإخصاب في درجة حرارة منخفضة (حوالي 4 درجات مئوية)2،4. وبالتالي، ينبغي وضع أجهزة التبريد لتجنب ظروف العمل غير مريح. وباﻹضافة إلى ذلك، المني الأسماك اسم في السائل المنوي وتتطلب حدوث صدمة ناضح بتنشيط حركية. المتوسطة المنشط لأسماك المياه العذبة، ينبغي أن يكون osmolality ناقص التوتر، بينما ينبغي أن تكون المتوسطة مكثف للأنواع البحرية. ومع ذلك، لبعض الأنواع، كالسلمون، تركيز أيون يمكن أيضا هامة3،،من49. بعد التنشيط، تتميز بانخفاض سرعة حركية (أقل من 2 دقيقة)13،14 والسرعة العالية، ويجري حيوية لتحديد معدل الإطار الأمثل للحصول على بيانات موثوق بها15الأسماك الحيوانات المنوية.
أهداف هذه الدراسة هي لتصميم وتطبيق نظم التبريد لعينات الحيوانات المنوية من الأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يعرف هذا البروتوكول كيفية تحديد معدلات الإطار الأمثل لوضع بروتوكولات قياسية تبعاً للأنواع الأحيائية. استخدام هذا البروتوكول يفتح أبواباً جديدة في سياق التقييم المنوي الأسماك، استخدام ثعبان البحر الأوروبي كنموذج.
برمجيات تحليل الحيوانات المنوية المستخدمة في هذا البروتوكول قد استخدمت الباحثين في جميع أنحاء العالم لمختلف الأنواع، بما في ذلك الأسماك. ومع ذلك، قد الأسماك بعض السمات المحددة التي يمكن أن يؤثر على تقييم الحيوانات المنوية. وأظهرت المني الأسماك عالية السرعة في لحظة التنشيط التي تنخفض بسر…
The authors have nothing to disclose.
هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من رابطة التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي، وبرنامج الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث والابتكار تحت ماري سكلودوفسكا كوري المشروع إعجاب (GA لا 642893). ونود أن نشكر فريق علمي من برويسير، على وجه التحديد للطالب ألبرتو فندريل بيرنابيو، لمشاركته النشطة في تسجيل الفيديو من هذا المشروع.
Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
Cooler block | PROiSER | Prototype | |
ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |