نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنتاجها إسكات الجينات مورين ناغورني كاراباخ الخلايا باستخدام نظام تمايز خالية من التغذية للدراسة الميكانيكية في المختبر و في فيفو.
تنتمي إلى نظام المناعة الفطرية الطبيعية القاتل من الخلايا (ناغورني كاراباخ) وهي الخط الأول لمكافحة سرطان المناعي دفاع؛ ومع ذلك، أنها تقمع في ورم المكروية والآلية الأساسية التي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. يحد عدم وجود مصدر متسقة وموثوق بها للخلايا ناغورني كاراباخ تقدم البحوث الحصانة خلية ناغورني كاراباخ. هنا، نحن التقرير في المختبر نظام التي يمكن أن توفر عالية الجودة والكمية المستمدة من نخاع العظم خلايا ناغورني كاراباخ مورين تحت شرط خالية من علبة التغذية بالورق. الأهم من ذلك، نبدي أيضا إسكات الجينات بوساطة siRNA أن يمنع نضوج الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ بنجاح باستخدام هذا النظام. وهكذا، هذه الرواية في المختبر ناغورني كاراباخ الخلية التفريق بين النظام حل مادة بيولوجية للبحوث الحصانة.
تطور السرطان يعتمد إلى حد كبير على ورم المكروية1،2، بما في ذلك إيمونوسيتيس المستمدة من المضيف، مثلاً، خلايا ناغورني-كاراباخ. وأظهرت دراسات عدة أن ناغورني كاراباخ intratumoral الخلايا ترتبط سلبا مع3،4تطور الورم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات السريرية أن ناغورني كاراباخ خلية العلاج التبني استراتيجية ممكنة للسرطان5،،من67،،من89. ناغورني كاراباخ المستندة إلى خلايا السرطان العلاج المناعي قد اقترح مؤخرا كخيار علاجي للأورام الصلبة، ولكن توجد تحديات بسبب إفراز السيتوكينات كآبته ودوونريجوليشن لتفعيل يغاندس في المكروية الأورام الصلبة 10،11. تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) قد اقترح القيام بدور قمعية في التسرطن، ولكن من المفارقات أيضا إنتاج الخلايا السرطانية TGF-β1 لدعم التنمية ورم12،،من1314 , 15-مما يشير إلى TGF-β يمكن قمع النشاط عن ناغورني كاراباخ الخلايا عن طريق تنظيم أسفل استجابة انترفيرون ووساطة CD16 انترفيرون-غاما (IFN-γ) الإنتاج في المختبر16،17، 18.
على الرغم من أن قد يكون تعطل إشارات TGF-β في ورم المكروية طريقة ممكنة للقضاء على أمراض السرطان، حجب تماما مما يشير إلى TGF-β سوف يسبب أمراض المناعة الذاتية بسبب وظيفتها للالتهابات، كما يدل على ذلك وضع الآثار الجانبية الضارة بما في ذلك التهاب النظامية، تشوهات القلب والأوعية الدموية، والمناعة الذاتية في الماوس نماذج19. ومن ثم، فهم إليه العامل TGF-β-بوساطة الكبت المناعي سوف يؤدي إلى تحديد هدف العلاجية موجوداً لعلاج السرطان.
لتوضيح الأحداث الجزيئية الضرورية للتنمية الخلية ناغورني-كاراباخ، أنشأت ويليامز et al. نظاما في المختبر للتفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام مورين في ناغورني كاراباخ الخلايا20. وييسر هذا النظام إلى حد كبير الدراسة الميكانيكية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ، بما في ذلك تحديد المتكفل رواية من ناغورني كاراباخ الخلايا21. ومع ذلك، ينبغي أن تكون مثقف المتكفل نخاع العظام في النظام مع دعم الخلايا اللحمية OP9 كتغذية طبقة20،21، ويحد هذا السكان خلية غير متجانسة إلى حد كبير تطبيق مزيد من تعطيل الجينات أدوات (مثلاً، إسكات الجينات بوساطة siRNA) المطبقة على وجه التحديد إلى تمييز الخلايا ناغورني-كاراباخ.
وهنا يصف لنا نظام خال من علبة التغذية بالورق الذي تم وضعه عن طريق زيادة تعديل النظام في المختبر وآخرونويليامز20. في نظامنا، وخلايا التغذية اللحمية OP9 غير مطلوبة، وبدلاً من ذلك OP9 يستخدم المتوسط الشرطي دون التأثير على التفريق بين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر، وهذا مؤخرا يؤدي بنا إلى الكشف عن أن TGF-β غير قادرة على تعزيز تطور السرطان عن طريق قمع التنمية الخلية E4bp4-تعتمد على ناغورني كاراباخ في ورم المكروية22. ويوفر هذا النظام الرواية بنجاح أسلوب خال من الخلفية لتوضيح الآلية الجزيئية للتنمية الخلية ناغورني كاراباخ تحت شروط معينة (مثلاً، ارتفاع TGF-β1، إسكات الجينات بوساطة siRNA، إلخ.) في المختبر.
في هذا العمل، لقد قمنا بوصف طريقة جديدة لإنتاج المشتقة من نخاع العظم مورين ناغورني كاراباخ الخلايا في المختبر. وحدة تغذية الخلية في21،النظام الأصلي22 بنجاح محله المتوسطة الشرطي من الخلايا OP9، مما زاد إلى حد كبير في استقرار نظام التمايز. وبالإضافة إلى ذل?…
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة كانت تدعمها في البحوث منح مجلس هونج كونج (لجنتي 468513، CUHK3/نموذج الإبلاغ الموحد/12R) والابتكار والتكنولوجيا صندوق هونغ كونغ (ITS/227/15، للبحث عن البرنامج النووي العراقي/164/16، للبحث عن-البرنامج النووي العراقي/242/16)، منحة مباشرة للبحوث-الصينية (2016.035)، وعلماء هونج كونج البرنامج.
حاء-Y.L. تصميم والإشراف على جميع التجارب وساهمت في إعداد مخطوطة. بعد الظهر-ك. ت. أجرى تجارب وتحليل البيانات، وساهمت في إعداد مخطوطة. رمز بريدي-ت. ت، ج. ي-نادي، س. ج. س.-جيم، حاء،-M.W.، وزاي-Y.L. جمع العينات الحيوانية وشاركت في التجارب على الحيوانات. ج. س.، عاشرا-الصحة الإنجابية، و F.T. ك. ساهمت في إعداد مخطوطة.
OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |