Autoanticuerpos DFS70 imitan patrones de anticuerpos antinucleares asociados a enfermedad comunes haciendo interpretación desafiante al usar sustratos convencionales de HEp-2. El protocolo describe ventajas de sustrato de HEp-2 Ingeniería novela sobre HEp-2 convencional en ANA screening y distinguir patrones de DFS70 con alta confianza en monoespecíficas y mixtas en casos positivos de ANA.
Trastornos autoinmunes sistémicos del tejido conectivo se caracterizan por circulación de los anticuerpos antinucleares (ANA). Aunque hay varias tecnologías disponibles para ANA screening, inmunofluorescencia indirecta (IIF) usando humano (HEp-2) de 2 células epitelial sustrato sigue siendo el método principal y recomendado debido a su sensibilidad superior. HEp-2 sustratos pueden detectar multitud de patrones resultantes de unión de autoanticuerpos a diversos autoantígenos proteína y ácido nucleico, distribuidos por el núcleo y el citoplasma de las células. La gran diversidad de monoespecíficas y patrones mixtos resultantes de las reacciones positivas sobre sustrato HEp-2 también complican la interpretación y precisión de la información. Un ejemplo concreto que recibió mayor atención recientemente es el denso fino 70 (DFS70) patrón moteado por autoanticuerpos que se unen específicamente a una proteína llamada factor de crecimiento derivado del epitelio de lente (LEDGF). Falta de clara asociación con enfermedad autoinmune sistémica específica y alta prevalencia en poblaciones saludables han hecho interpretación del patrón de DFS70 importante. Distinción exacta de DFS70 patrón de patrones asociados a la enfermedad usando sustrato HEp-2 convencional es difícil. Por otra parte, co-ocurrencia frecuente del patrón de DFS70 junto con patrones asociados a la enfermedad como patrones homogéneo moteado homogéneos, moteados y mixtos de complicar la interpretación de IIF. El objetivo de este trabajo es demostrar que la utilidad de una novela de ingeniería sustrato HEp-2 IIF que conserva todas las ventajas del sustrato HEp-2 convencional mientras que al mismo tiempo proporcionando la capacidad de distinguir patrones de DFS70 con alta confianza en ambos monoespecíficas y mixtos ejemplos positivos de ANA. El nuevo substrato es más capaz de desenmascarar patrones ANA asociada a enfermedad ocultados previamente por el patrón de DFS70.
ANAs son un sello de sistémica mediada autoinmunes del tejido conectivo enfermedades1. Se emplean varios métodos para la detección y confirmación de ANAs. Técnica IIF utilizando restos de sustrato HEp-2 el más ampliamente utilizado y método para la detección de ANAs1,2con frecuencia recomendado. A pesar de avances en metodologías de diagnóstico análisis de fase sólida como análisis de enzima ligado del inmunosorbente (ELISA), enzimoinmunoanálisis (EIA), inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) y ensayos multiplexores de grano, IIF por HEp-2 es la proyección más prevalente método debido a su utilidad diagnóstica y costo efectividad1,2,3. Las tecnologías de análisis antes mencionadas se basan en un conjunto limitado de nativa purificada o autoantígenos recombinantes mientras que las preparaciones de monocapa de células HEp-2 en pozos de portaobjetos de vidrio presentan una amplia gama de autoantígenos en su forma natural, distribuyen en el núcleo y el citoplasma, reaccionan con los autoanticuerpos de sueros de pacientes o de controles positivos, dando por resultado una multitud de patrones que se asocian a varias condiciones autoinmunes. Estos patrones se clasifican en nucleares, citoplasmáticos y mitóticos patrones basados en la localización del antígeno en las células. Cada patrón y los antígenos de antígeno asociados y Estados de enfermedad son bien caracterizado4. En el método IIF, paciente y control de sueros se incuban en pozos de portaobjetos de vidrio que presentan una cultura de la monocapa de células HEp-2 convenientemente fijados para preservar una multitud de autoantígenos en su configuración natural. Los autoanticuerpos en el suero del paciente o en los controles positivos se permiten enlazar a los autoantígenos presentados por células HEp-2 en el substrato (portaobjeto bien) durante la incubación. Post incubación, los anticuerpos no Unidos son lavados apagado y los anticuerpos encuadernados de la clase IgG se detectan con fluoresceína/fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti humano IgG reactivo. Registrados-conjugado no Unido se lava lejos y el cubreobjetos de vidrio se montan encima de las diapositivas utilizando un medio de montaje que conserva las reacciones y facilita la observación bajo un microscopio de fluorescencia. Las reacciones son observadas bajo un microscopio de fluorescencia equipado con combinación de filtro de emisión excitación apropiada que se configura según el reportero utilizado (reportero de la FITC, un microscopio diagnóstico típicamente utiliza filtros con rango de excitación de 467 -498 nm y una gama de emisión de 513-556 nm). La presencia de ANA es demostrada por una fluorescencia verde brillante de estructuras específicas en las células. A diferencia de plataformas de análisis automatizado, metodología IIF se basa en el laborioso proceso de dilución de los sueros y la determinación positiva visual de los patrones de tinción que requiere usuario importantes conocimientos5,6serial. A pesar de estas limitaciones, IIF por HEp-2 sigue siendo el más utilizado y método para la detección de ANAs debido a los esfuerzos de normalización hacia patrón interpretación y nomenclatura recomendado por el consenso internacional sobre ANA Comité de patrones (ICAP), mayor disponibilidad de soluciones de automatización para IIF Deslice el procesamiento y la interpretación de resultados3.
Entre la multitud de patrones detectó por el método de HEp-2 IIF, autoanticuerpos contra el producto del gene psip1 (también denominado LEDGF/p75/DFS70), han ganado gran interés en los últimos años por varias razones4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 los autoanticuerpos están presentes en altos títulos en controles sanos, y los estudios hasta ahora no han podido demostrar una asociación clínica distinta de la presencia de DFS70 autoanticuerpos7,8,9 ,10,11,12,13. Las tarifas de divulgado resultados positivos para autoanticuerpos DFS70 en varios Estados de la enfermedad y cohortes sanas variadas ampliamente entre los estudios6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. El patrón monoespecíficas DFS70 bien se distingue de un patrón homogéneo o moteado pero interpretación de patrones mixtos homogéneos manchadas y anticuerpos anti-DFS70 Co que ocurre con otras ANAs es un reto incluso para los lectores expertos. La actual generación de IIF DFS70 fase sólida específica análisis y métodos de detección no es capaces de distinguir un monoespecíficas DFS70 reacción de patrones mixtos (figura 1A, zona sombreada amarilla del algoritmo). Interpretación de DFS70 patrón homogéneo, moteado, patrón mezclado o viceversa, puede tener graves consecuencias en el cuidado del paciente. El actual protocolo comúnmente utilizado es el siguiente: los laboratorios clínicos emplean una serie de pruebas confirmatorias de fase sólida para ANAs asociada a enfermedad o un método de immunoadsorption para DFS70/LEDGF cuando denso fino moteado patrón (AC-2) se sospecha (figura 1a)4,5.
El objetivo de este protocolo es demostrar la utilidad de una novela de ingeniería sustrato HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 nocaut (KO), se hará referencia a como élite de HEp-2) que conserva todas las ventajas de convencionales HEp-2 para la detección de ANAs, mientras que al mismo tiempo distinguir el patrón de DFS70 con alta confianza en monoespecíficas y mixtas ANA casos positivos (figura 1B, zona sombreada amarilla del algoritmo)5. Sustrato HEp-2 élite está compuesto por una mezcla aproximada de ingeniería células desprovista de antígeno LEDGF/p75/DFS70 en proporción de 1:95y sin modificar células HEp-2 convencionales. El procedimiento de la IIF para ELITE de HEp-2 es idéntico del método convencional de HEp-2. La configuración única de sustrato HEp-2 ELITE no sólo conserva todas las ventajas de HEp2 convencional pero puede distinguir patrones de reacción homogéneo, moteado y mixtos de patrón de DFS70 en la evaluación inicial o prueba de una muestra (figura 1B )5. Suero del paciente a reaccionar en diapositivas con sustrato HEp-2 IIF debe ser diluidas 1:40 dilución de screening o según el criterio de laboratorio individual. Una reacción específica en el 1:40 o título superior se considera positiva.
En este estudio, los sueros positivos para centrómero homogéneo, moteado, nucleolar, citoplasmática reticular/AMA y patrones de DFS70 que produce una señal positiva media (en relación con el control negativo y control positivo de ANA proporcionado por el kit) en proyección dilución de 1:40 fueron seleccionados para simular los patrones mono específicos y mixtos en sustratos HEp-2 (convencionales y HEp-2). La 1:40 diluido DFS70 sueros positivos fueron mezclados con 1:40 diluciones de ANA enfermedad asociado individual patrón controles (homogéneo, moteado, centrómero, nucléolo, o citoplasmático reticular-AMA) en diferentes proporciones (control: DFS70 100: 0, 80: 20, 50: 50, 20:80 y 0:100) y evaluado en convencional y sustratos HEp-2 ELITE siguiendo el procedimiento estándar del IIF se detallan a continuación.
Autoanticuerpos a los antígenos nucleares y citoplasmáticos son altamente prevalentes en enfermedades autoinmunes sistémicas. Aunque no solo análisis proporciona la mejor sensibilidad y especificidad, IIF por HEp-2 es ampliamente considerado como un método de detección altamente sensible y rentable para las enfermedades autoinmunes sistémicas2,3,4 . A pesar de la prevalencia de protocolo de la IIF para más de 50 años, exactitud del ensayo IIF es altamente dependiente de la habilidad del técnico, la ejecución cuidadosa de cada paso del protocolo y precisa interpretación de los resultados con un buen mantenimiento microscopio de fluorescencia. Diagnóstico de enfermedad autoinmune sistémica no debía basarse en los resultados de una sola prueba serológica como IIF por HEp-2.
Reconstitución de los reactivos con alta calidad de agua (agua destilada/desionizada), el uso de componentes estandarizados (diapositivas con monocapas de células HEp-2, diluyente de muestra, controles positivos y negativos, previamente diluido conjugado FITC optimizado y el medio de montaje) tener un impacto positivo en los resultados. Omitiendo la adición de controles o las muestras de pozos puede fomentar falsas interpretaciones negativas. De secado de diapositivas en cualquier momento después de la adición de la muestra o control puede ocasionar reacciones positivas falsas artifactual y/o patrones incorrectos. Sobre diapositiva demasiado tampón de lavado o secado de los pozos de la diapositiva antes de la dispensación de medio de montaje puede resultar en artefactos. Agregar suficiente cantidad de medio de montaje o generación de burbujas en la superficie de la diapositiva antes de colocar un cubreobjetos puede provocar reacciones que se ven borrosas o fuera de foco cuando se observa bajo el microscopio. Diapositivas montadas deben ser almacenadas a 2-8 ° C y analizados dentro de la ventana recomendada de tiempo para minimizar falsos negativos o artifactual.
Utilizando un microscopio epi-fluorescente bien conservado que alberga una fuente de luz apropiada de Hg/LED/xenón y ópticos limpio componentes incluyendo filtros de excitación y de emisión que no estén dañados es fundamental para obtener resultados precisos de IIF. Usuario final para discriminar intensidades de reacción positiva/negativa e interpretación de patrones de entrenamiento es fundamental. Ensayos de IIF de HEp-2 son vulnerables a la falta de estandarización de procedimientos, configuración del microscopio y formación del usuario final o habilidad. Los patrones de nomenclatura y representante de consenso y ejemplos de imágenes adquiridas con distintos fabricantes son hechos disponibles por ICAP () para fines didácticos4. Un árbol de clasificación de patrón celular HEp-2 proporcionado por ICAP para varios patrones nucleares, citoplasmáticos y mitóticos es un valioso recurso para aprender las diferencias sutiles entre varios patrones que pueden parecerse a los ojos inexpertos4. Uno de los principales ejemplos de un patrón desafiante es el DFS70 que también carece de una clara asociación con una condición autoinmune, y como comentamos en secciones anteriores este patrón es altamente prevalente en poblaciones saludables5.
Según el estudio, la prevalencia de autoanticuerpos anti-DFS70 varían entre cohortes sanas, ANA proyección de poblaciones y personas positivas de ANA sin evidencia de enfermedad autoinmune sistémica9,16,20 ,30,31. DFS70 autoanticuerpos se han divulgado para ocurrir en el aislamiento, así como con otros patrones de ANA enfermedad asociada. Aislado o monoespecíficas DFS70 patrón se reporta en el 2-22% de controles sanos, pero en menos del 1% de los casos con enfermedad reumática autoinmune32. Partiendo de estas tendencias, DFS70 patrón de mono-positivo fue propuesto como un criterio para excluir en las enfermedades reumáticas autoinmunes por ICAP Comité3,31,32. El Comité ICAP, creado para promover la armonización de la nomenclatura de la prueba de autoanticuerpos y la interpretación de los resultados de HEp-2 IIF, recomienda informar positividad DFS70 mientras informes ANA proyección de resultados4.
Antes de descartar una enfermedad autoinmune sistémica basada en DFS70 mono-positividad, es vital revisar el estado de los actuales métodos de cribado y confirmación (particularmente las específicas para DFS70). Acuerdo entre positividad por IIF HEp-2 y ensayos confirmatorios fase sólida: ELISA DFS70, CLIA y línea inmunoensayo/dot blot métodos) varió ampliamente entre distintos estudios13,22,25,33 . Interpretación del IIF y ensayo confirmatorio parámetros que contribuyen a este desacuerdo han sido discutieron previamente5,13,34. Un enfoque del immunoadsorption recientemente propuestos para la confirmación de anticuerpos anti-DFS70 aborda algunas de las deficiencias de los ensayos actuales de fase sólida (para DFS70) pero requiere de los laboratorios para realizar un paso adicional en el procedimiento IIF en muestras sospechosas, que aumenta el tiempo costo y entrega de informes de resultados13. Este paso adicional no es necesaria cuando se utilizan células HEp-2 ELITE/DFS70 KO para el cribado de rutina ANA. Esto reduce los costos y además no hay ningún impacto en el tiempo de respuesta como patrón DFS70 es discernir en la investigación inicial paso27. Una desventaja adicional del método convencional de HEp-2 si es que es incapaz de distinguir el patrón de DFS70 Co que ocurre con otros ANA patrones en la etapa de proyección. Sin embargo, esta desventaja es superada por el uso de las células HEp-2 KO ELITE/DFS7027.
Evaluación comparativa de convencionales HEp-2 y la nueva ingeniería HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) utilizando controles positivos de ANA y sus combinaciones con un control de DFS70 mono-positivo, demostrar la utilidad de la capacidad del nuevo sustrato simultáneamente pantalla para ANAs y confirmar el patrón de DFS70 (figura 1). El protocolo IIF para el substrato nuevo es idéntico del método convencional de IIF de HEp-2. Esquema de interpretación para patrones todo asociada a la enfermedad de ANA es idéntico a excepción del patrón de DFS70 (tabla 1). Interpretación de patrones de DFS70 mono-positivo y mixtos era relativamente más fácil utilizando el nuevo método y no garantiza ensayos adicionales (figura 1B). Implementación de este nuevo método en el laboratorio clínico simplifica el reto asociado con la interpretación del patrón de DFS70 y mejora la precisión de la ANA screening revelando más asociada a la enfermedad de ANA patrones previamente ocultados por DFS70 (mezclada de patrones).
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Andrew Zenger para realizar los experimentos de la IIF y la recolección de imágenes.
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |