Summary

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Published: December 26, 2017
doi:

Summary

Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.

Abstract

Macrofagen zijn fagocytische ingeboren immune cellen, die initiëren immuunresponsen ziekteverwekkers en bijdragen tot de genezing en weefsel teruggave. Macrofagen zijn even belangrijk in het uitschakelen van inflammatoire reacties. We hebben aangetoond dat macrofagen gestimuleerd met intraveneuze immunoglobuline (IVIg) grote hoeveelheden van de anti-inflammatoire cytokine, interleukine 10 (IL-10), en lage niveaus van pro-ontsteking cytokinen in reactie op bacteriële lipopolysacchariden produceren kunnen ( LPS). IVIg is dat een polyvalente antilichaam, voornamelijk immunoglobulin Gs (IgGs), gebundeld uit het plasma van meer dan 1.000 bloeddonoren. Het wordt gebruikt ter aanvulling van antistoffen bij patiënten met een immuun tekortkomingen of onderdrukken van de immuunrespons bij patiënten met auto-immune of inflammatoire voorwaarden. Infliximab, een therapeutische anti-tumor necrose factor alpha (TNFα) antilichaam, heeft ook aangetoond dat het activeren van de macrofagen voor de productie van IL-10 in reactie op inflammatoire stimuli. IVIg en andere antilichaam gebaseerde biologics kan worden getest om te bepalen hun effecten op de macrofaag activering. Dit document wordt beschreven methoden voor afleiding, stimulatie en beoordelingvan lymfkliertest beenmerg macrofagen geactiveerd door antilichamen in vitro en lymfkliertest peritoneale macrofagen geactiveerd met antilichamen in vivo. Tot slot tonen wij het gebruik van het westelijke bevlekken om te bepalen van de bijdrage van specifieke cel signalering emissieroutes naar de anti-inflammatoire macrofaag activiteit. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met genetisch gemodificeerde muizen, om te bepalen van het effect van een specifieke expressie gebrachte eiwitten op anti-inflammatoire macrofaag activering. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om te beoordelen of specifieke biologics optreden kan door macrofagen omzetten in een IL-10-producerende anti-inflammatoire activeringsstatus die inflammatoire reacties- in vivo vermindert. Dit kan informatie verschaffen over de rol van macrofaag activering in de werkzaamheid van biologics tijdens ziekte modellen in muizen, en bieden inzicht in een potentiële nieuwe werkingsmechanisme bij mensen. Omgekeerd, dit kan waarschuwen tegen het gebruik van specifieke antilichamen gebaseerde biologics voor de behandeling van besmettelijke ziekten, vooral als de macrofagen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de gastheer tegen die infecties.

Introduction

Macrofagen zijn ingeboren immune cellen, die meerdere rollen in de immuunrespons op infectie of verwonding spelen. Macrofagen zijn verantwoordelijk voor het initiëren van een immuunrespons op infectie of weefsel schade, stoppen de ontstekingsreactie, en bevordering van de helende reactie1. Voorbeelden van de best bestudeerde macrofaag activering statussen zijn: 1) macrofagen, behandeld met interferon gamma (IFNγ) en bacteriële lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), aangewezen die bijdragen tot de inflammatoire respons; 2) macrofagen gestimuleerd met Interleukine (IL-4), 4 M(IL-4), die geassocieerd met de helende reactie worden; 3) macrofagen gestimuleerd met immuuncomplexen (IC) en LP’s, M (IC + LPS), die de mogelijkheid hebben om het uitschakelen van de ontstekingsreactie2,3. M (IC + LPS) onderscheiden van M(IL-4) wond genezing van macrofagen, en doen niet uiten het arginase enzym (Arg-1) of de FIZZ14. De beste teller voor deze anti-inflammatoire macrofagen is hun cytokine productie5. Macrofagen hebben meerdere rollen bij het handhaven van de gezondheid, maar ook bijdragen tot inflammatoire ziekten en kanker3. Hierdoor zijn de macrofagen een belangrijk therapeutisch doel voor de behandeling van een breed scala van ziekten. Het is belangrijk om te onderzoeken van de effecten van antilichamen op hun activeringsstatus te ontwikkelen macrofaag gebaseerde behandelingen voor ziekte.

Dit document richt zich op het gebruik van lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) en peritoneale macrofagen voor het testen van het effect van antilichaam drugs op inflammatoire reacties in vitro en in vivo. Onlangs, zijn er meerdere studies waaruit blijkt van de effecten van antilichamen macrofaag activering6,7,en8. Macrofagen mede geactiveerd met immuuncomplexen, die antilichamen complexvorm met een antigeen, en LP’s, een normaal inflammatoire prikkel, produceren zeer hoge niveaus van anti-inflammatoire cytokine, IL-10, en zeer lage niveaus van de pro-inflammatoire cytokine, interleukine 12 (IL-12)9. In toevoeging, infliximab, een monoclonal antilichaam tegen TNFα, te werken, ten dele door de anti-inflammatoire macrofagen via haar fragment crystallizable (Fc) regio7inducerende is gebleken. We hebben gemeld dat IVIg + LPS veroorzaken anti-inflammatoire macrofaag-activering dat is vergelijkbaar met M (IC + LPS), waarin mede gestimuleerde macrofagen produceren grote hoeveelheden van IL-10 en lage bedragen van de pro-inflammatoire cytokine subeenheid interleukine 12 of 23 p40) Il-12/23p40), Interleukine-6 (IL-6) en TNF8. IVIg is een drug die bestaat uit polyclonal antilichamen, voornamelijk IgG, die uit het bloed van meer dan 1.000 donoren10heeft zijn gebundeld. Het wordt gebruikt voor de behandeling van een breed scala aan immunologische ziekten, zoals idiopathische trombocytopenische purpura en chronische demyeliniserende polyneuropathie, maar zijn werkingsmechanisme is niet volledig begrepen11. De effecten van antilichaam gebaseerd drugs op macrophage activering kunnen worden geschat aan de hand van de beschreven methoden hierin.

De effecten van specifieke biologics op macrophage activering kunnen worden getest in BMDMs en peritoneale macrofagen. Met deze macrofaag-bronnen kunt beoordeling van primaire cellen. Voorbereidende tests van antilichamen op gekweekte primaire cellen vergt minder tijd en monetaire investeringen dan andere modellen tijdrovend en duur ziekte. Door het injecteren van een geneesmiddel in een gezonde muis in vivo, en isoleren van de cellen en analyseren ze ex vivo, kan men bepalen als studies om te beoordelen of de behandeling met biologics is van invloed op macrophage activering in ziekte modellen zijn gerechtvaardigd.

Met weinig studies die het effect van biologische therapieën op macrophage activering in vitro en in vivo direct testen, bieden onze technieken een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken. Huidige technieken betrekken testen biologische drug effecten op gemengde cel populaties in vitro, zoals het effect van infliximab in een gemengde lymfocyt reactie (MLR) of IVIg op menselijke macrofagen in perifere bloed mononucleaire cellen, waar het effect niet kan worden toegeschreven aan een bepaalde cel type7,12. Met behulp van BMDMs en peritoneale macrofagen is gunstig over het gebruik van cellijnen, zoals RAW264.7 cellen, die niet de pro-inflammatoire cytokine produceren, IL-12, in reactie op LPS8,13. Testen van het effect van een antilichaam gebaseerde drug op macrophage reacties ex vivo heeft voordelen omdat cytokine reacties kunnen rechtstreeks worden toegeschreven aan macrofagen, in plaats van macrophage reacties afgeleid door het meten van serum cytokine niveaus14 . BMDMs en peritoneale macrofagen kunnen worden afgeleid en geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muizen om te bepalen van de specifieke rol van een proteïne in anti-inflammatoire macrofaag activering. Bijvoorbeeld, hebben we gebruikt Il10 gebrekkige(- / –) BMDMs om aan te tonen dat IVIg-geïnduceerde vermindering van pro-inflammatoire cytokine productie gedeeltelijk afhankelijk van IL-10,8 is. Van een drug werkingsmechanisme kan worden onderzocht gebruikend het westelijke bevlekken, waar de rol van specifieke proteïnen en signalering gebeurtenissen kan worden bepaald. Kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) kunnen worden uitgevoerd op BMDMs of peritoneale macrofagen weer te geven van de patronen van de genexpressie die uit een antilichaam activering voortvloeien. Modellen van de ziekte in muizen kunnen informatie geven over de mogelijke werkzaamheid van antilichaam gebaseerde biologische therapieën in modellen voor ziekten zoals inflammatory bowel disease, reumatoïde artritis en kanker15,16, 17. de hier beschreven technieken zal echter informatie verschaffen over het werkingsmechanisme van deze biologics door te bepalen of ze anti-inflammatoire macrofaag activiteit veroorzaken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of British Columbia. 1. het beenmerg Macrophage afleiding en activering met antilichamen Met behulp van CO2 verstikking euthanasie uitvoeren. Plaats de muis in inductie kamer. Euthanaseren muis met 5% Isofluraan anesthesie, voor 60-90 s, totdat ze stilstaan en ademhaling diep en traag is. Uitschakelen van Isofluraa…

Representative Results

Lymfkliertest bot beenmerg afgeleid macrofagen kunnen worden gekweekt van hematopoietische cel precursoren in beenmerg aangeblazen. Het beenmerg aangeblazen gebundeld van dijbeen en zijn verbeend van één C57BL/6 muis meestal opbrengst 107 beenmerg afgeleid macrofagen, waardoor ze een handige bron van macrofagen voor experimenten. BMDMs kan worden gebruikt om te testen antilichaam gebaseerd drug reacties wanneer uitgedaagd met een inflammatoire stimulans in vitro. <st…

Discussion

Macrophage activering Staten spelen een belangrijke rol in beide weefsel homeostase en ziekte22. Macrofagen hebben verschillende evenals het overlappende activering Staten, afhankelijk van de signalen in hun communicatie-3. Ze hebben verschillende rollen in alle stadia van de inflammatoire respons: verdediging tegen ziekteverwekkers, wond genezing en weefsel teruggave, en hebben ook een duidelijke anti-inflammatoire activeringsstatus dat belangrijk is voor het uitzetten van…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.K. is de ontvanger van de University of British Columbia 4 jaar fellowship (4YF) graduate studententijd award. L.M.S. is de ontvanger van een Canadese Vereniging van de gastro-enterologie / ziekte van Crohn en Colitis Canada / CIHR nieuwe onderzoeker salaris Award en is een biomedische van de Michael Smith Stichting voor gezondheidsonderzoek. Dit werk werd gesteund door een projectsubsidie van Canadese bloed Services, in samenwerking met de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen # CIHR2016-LS).

Materials

Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) Life technologies 12440053
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 12483-020
Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) Stemcell technologies 78059
Penicillin-streptomycin Life technologies 15140148
Monothioglycerol (MTG) Sigma 88640
1X red blood cell lysis buffer eBioscience
Cell dissociation buffer Life technologies 13150016 Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma aldrich L 4516 From E. coli 0127:B8
IVIg (Gammunex) Grifols Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
IVIg (Gammagard liquid) Baxter Healthcare Corporation Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
IVIg (Octagam) Octapharma Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine
Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 Life technologies 10010023
mouse IL-10 ELISA BD biosciences 555252
mouse IL-12/23p40 ELISA BD biosciences 555165
anti-Erk1/2 antibody Cell signalling technology 9101
anti-pp38 antibody Cell signalling technology 9211
anti-GAPDH antibody Fitzgerald industries 10R-G109A
26 g needle BD biosciences 305110
1 mL syringe BD biosciences 309659
10 mL syringe BD biosciences 309604
15 mL conical tube BD biosciences 352096
50 mL conical tube BD biosciences 352070
microcentrifuge tube (1.7 mL) Diamed SPE155-N
75 cm2 tissue culture treated flask BD biosciences 353136
Cell scraper BD biosciences 353085
Forcepts VWR 82027-386 fine tip, dissecting 
Scissors VWR 82027-582 Delicate, 4 1/2"
Brightfield microscope Motic AE31 Inverted phase contrast
Scale  Mettler  PE 3000

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
  3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
  5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
  7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
  8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
  9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
  10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
  11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
  12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
  13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
  14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
  15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
  16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
  17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
  18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
  20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
  22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
  24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
  25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
  26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
  27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
  29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
  30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
  31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kozicky, L., Sly, L. M. Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (130), e56689, doi:10.3791/56689 (2017).

View Video