Summary

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

הטרוגניות חלוקת תאים HER2 חיובי יכול להיות שנצפו בקבוצת משנה של סרטן השד ומייצר דילמות קליניים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול אמין וחסכוני להגדיר, לכמת, ולהשוות בין HER2 אינטרה-גידול הטרוגניות גנטית בסדרה גדולה של סרטן השד heterogeneously מעובד.

Abstract

טיפולים ממוקדים כנגד הקולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס 2 (HER2) השתנו באופן קיצוני את התוצאה של חולים עם סרטן השד HER2 חיובי. עם זאת, מיעוט מהמקרים הצגת התפלגות הטרוגנית של HER2 חיובי תאים, אשר יוצר אתגרים קליניים גדולים. נכון להיום, אין פרוטוקולים סטנדרטיים ואמין כדי להפוך את אפיון כימות של HER2 הטרוגנית הגברה ג’ין קוהורטות גדולות הוצעו. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה תפוקה גבוהה להעריך את מצב HER2 בו זמנית על פני אזורים שונים טופוגרפית של סרטן השד מרובים. בפרט, אנו ממחישים את ההליך מעבדה כדי לבנות מיקרו-מערכים רקמות משופרת (ניסית אותו בעבר) שילוב מיפוי יישוב של הגידולים. כל הפרמטרים TMA מוטבו במיוחד עבור כסף בחיי עיר הכלאה (SISH) של פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) רקמות השד. ניתוח Immunohistochemical של סמנים prognostic, ניבוי (קרי, ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2) צריכה להתבצע באמצעות הליכים אוטומטיים. פרוטוקול SISH מותאם אישית יושמה כדי לאפשר ניתוח מולקולרית באיכות גבוהה על פני מספר רקמות שעברו הליכים קיבעון, עיבוד, אחסון שונים. במחקר זה, אנו מספקים הוכחה-של-עיקרון כי רצפי DNA ספציפיים יכול להיות סרטן שד מקומי בו זמנית באזורים סימון שבילים ברורים של מרובה ולא מעובד heterogeneously באמצעות שיטה יעילה וחסכונית.

Introduction

HER2 נמצא proto-oncogene overexpressed, הוגדל ב- 15-30%1,סרטן שד פולשני כל2. HER2 ביטוי היא להסיק על ידי הנוכחות של > 10% תאים עם ממברנה חזקה immunohistochemical (IHC) צביעת (3 +), בעוד הגברה ג’ין יכול להידרש כאשר היחס HER2/צנטרומר הוא ≥2 או המספר עותק הגן הוא ≥6, כאשר על סופר לפחות 20 תאים על-ידי בחיי עיר הכלאה (איש)3.

הטרוגניות גנטית אינטרה-הגידול כבר נרחב שמתואר סרטן השד, להיות תורם פוטנציאלי לוואי הערכת סמנים ביולוגיים ו טיפולים תגובה4. על פי המכללה של אמריקאי פתולוגים (CAP), HER2 הטרוגניות קיימת אם HER2 מוגבר ב- > 5% ו- < 50% שחדר גידול תאים5. למרבה הצער, השכיחות האמיתית של HER2 הטרוגניות המרחבי סרטן שד נותרת כנושא למחלוקת בין פתולוגים עם יש מחברים שמירה על זה זהו אירוע נדיר ביותר, מציע את זה עד 40% של המקרים האחרים HER2-הטרוגניות1,5,6,7,8,9,10. למרות המנגנונים הביולוגיים לחזק תנאי זה לא עדיין מלא לאשורן, ההשפעות prognostic וקלינית של הטרוגניות HER2 אינטרה-גידול מכריעים עבור חולי סרטן השד11.

לאחרונה, טכניקות מולקולריות שדה בהיר, כגון הדפסות כסף איש (CISH) וכסף איש (SISH), הופיעו כפעולות אמין כדי לזהות HER2 הטרוגניות ברקמות FFPE, עם כמה יתרונות לעומת איש (פיש) פלורסנט12. למרבה הצער, ניתוח בכמות גדולה של מקרים בודדים נשאר מעשית בלימודי מחקר עוקבה גדול. מספר קבוצות הראו כי השילוב של להסטולוגיה, IHC ולאחר איש עם טכנולוגיות TMA יכול לייצג אסטרטגיה חשוב בחקר הסרטן ביולוגיה13,14,15,16. בשיטה זו אומץ באופן נרחב, דגימות רקמות מחולים שונים ניתן לנתח אותם במקביל, מזעור של רקמות, ריאגנטים המועסקים וטיפוח ובכך ניתוח אחיד של סדרה גדולה של מקרים14. עם זאת, אין פרוטוקולים זמינים עבור סימולטני תפוקה גבוהה מולקולרית אפיון דגימות רקמה מרובים שעברו שונים עיבוד במונחים של ריאגנטים, קיבוע פעמים ושיטות שימור מועסקים, כגון כמו ארכיון בלוקים.

לאור ההשלכות prognostic וקלינית של הטרוגניות המרחבי HER2 סרטן שד, פיתחנו פלטפורמה מולקולרית משולבת כדי להעריך את זה בסדרה גדולה של מקרים heterogeneously מעובד. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיות מעבדה ליצור ולנתח את הטרוגניות אינטרה-גידול של HER2 הגברה ניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד באמצעות SISH. הפרוטוקול הבא פותחה עבור גידולים מדידה > 5 מ מ (> pT1b על פי 2017 TNM)17. עבור נגעים קטנים יותר, אנו ממליצים על ביצוע הניתוח על עטיית מקטעים טורי. את הנהלים שלנו מאפשר ניתוח IHC ולאחר SISH בו זמנית של עד 30 סרטן השד, המקיף ממוצע של 6 תחומים ברורים (טווח 4-8) עבור כל מקרה. בסך הכל, 180 ליבות רקמות של 1 מ מ קוטר, עם 500 מיקרומטר בין הליבות, 2 מ מ בין הרשת לבין קצוות ייווצר עבור כל בלוק TMA.

Protocol

מחקר זה אושרה על-ידי הלוחות סקירה מוסדיים מרשות האישורים IRCCS’ המלון קרן, החולים פוליקליניקו (policlinico), מילאנו, איטליה. 1. מבחר של חולים, דגימות רקמות אחזר את השקופיות ארכיוני מכל מקרי שינותח, כולל כל hematoxylin זמין ו אאוזין (H & E), שקופיות IHC מן האבחנה המקורית ותואמים, אם היא קיימת…

Representative Results

מקצה לקצה, 444 שד פולשני סרטן סופחו 15 ניסית אותו בעבר הממוטבות במיוחד איש ניתוחים. בין המקומות 2,664 שנדגמו, 2,651 (99.5%) נציג של האזורים שנבחרו קודם לכן, ולכן נחשבת לשכנוע ניתוחים שלאחר מכן. אינטרה-גידול הטרוגניות נקבע על-ידי IHC ולאחר SIH, עם דגש מיוחד על חלוקות הטרוגנית של HER2 חיובי ש…

Discussion

. הנה, שתוארו האסטרטגיות מעבדה לביצוע ניתוחים SISH של הגן HER2 ו שלה צנטרומר המתאימה בניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד heterogeneously מעובד. שיטה זו היא חסכונית, יכול להתבצע במעבדות רוב לצורך המחקר של HER2 הטרוגניות ג’ין הגברה ב קוהורטות גדולות של השד סרטן לאחזר טופס פתולוגיה ארכיונים….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

. לא-

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. ‘Genetic heterogeneity’ in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies – a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

View Video