Analizzando la comunicazione tra i monociti e le cellule di cancro al seno primario in una tabella extracellulare estrarre (ECME)-sistema tridimensionale basato su
Summary
Qui, descriviamo un metodo di coltura tridimensionale per analizzare la morfologia del primario del seno le cellule tumorali, come pure per studiare le interazioni diretta/indiretta con i monociti ed i risultati come degradazione del collagene, reclutamento delle cellule immuni, cell invasione e promozione dell’infiammazione legata al cancro.
Abstract
Incorporato nella matrice extracellulare (ECM), cellule epiteliali normali e neoplastiche intimamente comunicano con le cellule ematopoietiche e non-emopoietici, influenzando notevolmente risultato di omeostasi e malattia del tessuto normale. Nel cancro al seno, macrofagi associati al tumore (TAM) svolgono un ruolo critico nella progressione della malattia, metastasi e ricorrenza; Pertanto, la comprensione dei meccanismi del monocito chemoattraction al microambiente tumorale e delle loro interazioni con le cellule del tumore è importante per controllare la malattia. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un sistema tridimensionale (3D) co-coltura di cellule tumorali (BrC) materno e monociti umani. BrC cellule prodotte i livelli elevati basali di regolamentato su attivazione, T-cellula normale espresso e secreto (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) e fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (G-CSF), mentre in co-coltura con i monociti, citochine proinfiammatorie interleuchina (IL) -1 beta (IL-1 β) e IL-8 sono stati arricchiti con metalloproteinasi della matrice (MMP) -1, MMP-2 e MMP-10. Questo microambiente stroma tumorale promosso resistenza all’anoikis in MCF-10A 3D dei acini-come le strutture, chemoattraction dei monociti e l’invasione delle cellule aggressive BrC. I protocolli presentati qui forniscono un’alternativa conveniente per studiare comunicazione intra-tumorale e sono un esempio le grandi potenzialità in vitro delle cellule 3D sistemi forniscono per interrogare la specificità della biologia dei sistemi tumorali correlate al tumore aggressione.
Introduction
Biologia del tumore è molto più intricata di quanto si pensasse. Prove di montaggio Mostra che le cellule del tumore sono più di una semplice massa incontrollate delle cellule di proliferazione; piuttosto, le cellule neoplastici differenti sembrano svolgere diverse funzioni visualizzazione alta organizzazione e gerarchia all’interno del tumore1. Le cellule del tumore sono in comunicazione intima con cellule non trasformate: fibroblasti, adipociti, linfociti, macrofagi, cellule endoteliali, tra le altre cellule sono tutti immersi nell’impalcatura proteine e polisaccaridi che costituiscono la ECM. Numerose interazioni dirette e indirette sono stabilite tra cellule trasformate e non trasformate e con la ECM, che esercita una potente influenza sulla malattia risultato2,3. Nel caso specifico di BrC, è particolarmente importante sezionare la comunicazione delle cellule BrC con TAMs, considerando che TAMs sono stati trovati a giocare un ruolo fondamentale nell’evoluzione del tumore, aumentando il rischio di metastasi e di ricorrenza di malattia4 ,5.
Per analizzare le interazioni intra-tumorali e loro possibili esiti, nuovi approcci per il 3D in vitro sono stati sviluppati basata sull’uso di estratti di ECM che forniscono un microambiente molto più complesso, più vicino alla realtà di biologia del tumore, in confronto ai colture cellulari monostrato convenzionale in cui le cellule crescono attaccato alla plastica. Petersen e Bissell6 fornito il primo modello di benigna e maligna delle cellule epiteliali mammarie coltivate su una membrana basale laminina-ricco e furono i primi a descrivere le strutture 3D organotipiche che discriminano benigni umani cellule epiteliali del seno dalle loro controparti maligne. Un decennio più tardi, il modello sviluppato da Debnath, Marinella, e Brugge7,8,9 fornito uno strumento prezioso per delucidare i percorsi biologici compromessi durante la trasformazione maligna dei acini ghiandolari, tali come formazione di acini grandi dovuto proliferazione incontrollata, delocalizzazione delle proteine di giunzione stretta come prova di polarizzazione cellulare alterata e la perdita del lume dei acini a causa della resistenza delle cellule all’anoikis, un tipo di morte cellulare programmata che si verifica in cellule di ancoraggio-dipendente quando si staccano dalla ECM circostanti. I modelli di Sameni, Jedeszko e Sloane si sono concentrati sulla formazione immagine attività proteolitica dalle cellule, che è strettamente correlata alla invasività, un’altra caratteristica fondamentale di tumore malignità10,11,12. Questi modelli si basano su matrici di proteina mescolati con substrati differenti estiguuto fluorescenza della proteina (DQ-gelatina, DQ-collagene I e DQ-collagene IV), in cui segnali fluorescenti sono indicativi della degradazione proteolitica di collagene. Modelli 3D sono utilizzati anche per studiare le proprietà delle cellule staminali di entrambi non trasformate e le cellule del tumore, in quale cella aggregati, chiamati anche sferoidi, possono essere coltivate in sospensione o in proteine ECM-like interrogando per meccanismi di differenziazione cellulare, asimmetrica divisione delle cellule, l’adesione cellula-cellula e cellula motilità13,14. Saggi di invasione consentono di testare l’aggressività intrinseca del tumore e l’identificazione delle molecole che fungono da chemioattrattanti durante il processo invasivo15. Nel complesso, 3D modelli rappresentano una conveniente diversificazione della coltura in vitro delle cellule che riflettono più molto attentamente la morfogenesi del tessuto normale e oncogeno.
Abbiamo progettato un sistema di co-coltura cellulare 3D basato sui suddetti modelli7,10,11, utilizzando sia linee cellulari BrC commerciale umane del noto potenziale aggressivo (tipi di luminal e triplo-negativi) e primaria cellule espiantate da BrC pazienti. In primo luogo abbiamo sviluppato un modello dove erano co-coltivate con i monociti U937 in un Estratto di matrice extracellulare (ECME) o non aggressivi (MCF-7) o cellule aggressive (MDA-MB-231) BrC-basato sistema 3D che ha permesso di interazioni cellula-cellula diretto. Questi co-colture sono state usate per determinare come la comunicazione tra questi lignaggi di due cellule influenzato la trascrizione di una serie di geni correlati al comportamento aggressivo di cancro. Un significativo aumento della trascrizione di ciclo-ossigenasi-2 (COX-2) è stato osservato che ha coinciso con un aumento della produzione di uno dei suoi prodotti, della prostaglandina E2 (PGE2), trovando quello ha evidenziato il ruolo dell’infiammazione nella progressione tumorale. Trascrizione aumentata di MMP inoltre è stato osservato che ha correlato con una maggiore proteolisi del collagene quando cellule MDA-MB-231 aggressive sono state co-coltivate con i monociti U937 in colture contenenti DQ-collagene IV. Della nota, il nostro co-colture non supportava l’ipotesi che i meccanismi di interazione cellula-cellula sono necessari per la degradazione del collagene. E ‘ piuttosto suggerito che la comunicazione tra i lignaggi di due celle è stata mediata da molecole secrete. Inoltre, i surnatanti raccolti da queste analisi di co-coltura contenevano fattori solubili che disorganizzato acini ghiandolari formati da non trasformate di cellule MCF-10A13. Si è constatato che aggressivo e cellule primarie di BrC secernute elevati livelli di molecole chemiotattiche monocito MCP-1, GM-CSF e RANTES. Così, abbiamo delineato una cultura 3D in cui le cellule sono state separate in cella cultura inserti per evitare interazioni cellula-cellula. Queste culture sono state usate per affrontare la comunicazione indiretta tra cellule BrC e monociti. Per queste analisi, non aggressivi e aggressive commerciale BrC linee cellulari e cellule primarie di BrC e tre diversi tipi di monociti umani: commerciale cellule U937 e THP-1 e monociti primari (PMs) isolati dal sangue periferico di donatori sani (tutti i monociti sono stati utilizzati in uno stato non attivato) sono stati usati. Aumento delle concentrazioni di citochine infiammatorie IL-1 β e IL-8 sono stati osservati per essere arricchito in co-coltura. Allo stesso modo, è stato trovato che la MMP-1, MMP-2 e MMP-10 inoltre sono stati aumentati nel BrC cellule monocito co-culture e così rinforzo precedente Risultati14. In questo manoscritto, un flusso di lavoro punto per punto di isolamento primario di cellule BrC e test in 3D culture è presentata con risultati rappresentativi. Quest’opera costituisce un buon esempio del grande potenziale che forniscono sistemi in vitro cell 3D per interrogare specifici aspetti della biologia del tumore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellule epiteliali crescono in una conformazione spaziale 3D e loro interazione con le proteine ECM è fondamentale per l’omeostasi del tessuto. Molti studi sul cancro sono stati basati sulle cellule coltivate in strati monomolecolari (2D) e anche se sono stati fondamentali per la comprensione di molti aspetti della formazione del tumore e la progressione, monostrati non ricapitolare le caratteristiche che l’ECM impone sulle cellule, per istanza: limitando la proliferazione, la sopravvivenza delle cellule adesione-dipend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE progetto n. 233061 a Ezequiel M. Fuentes-Pananá e da Fondo de Apoyo alla Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numero di progetto HIM-2014-053). NA di Espinoza-Sánchez è uno studente di dottorato da Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e ricevuta fellowship 231663 da CONACYT. NA E-S, riconosce anche il sostegno finanziario fornito dall’Istituto messicano di previdenza sociale (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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