Önceden klinik test için “yetim” ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.
Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) gibi nadir monogenic hastalıkları tedavi etmek için kişiselleştirilmiş ilaç kullanımı karmaşık klinik deneme tasarımları, yüksek maliyetleri ve düşük hasta sayıları tarafından reddedilmiştir. Mutant gen yüzlerce LSDs çoğunda karıştığı. Hastalıklar genellikle 2-3 farklı klinik tipi önem göre sınıflandırılır. Ayrıca, genotip moleküler karakterizasyonu klinik sonuçlar tahmin ve hasta bakımı hakkında bilgi yardımcı olabilir. Bu nedenle, biz heterologously Fabry ve Pompe hastalığı tespit mutasyonlar aşırı ifade HEK293H hücreleri temel alan bir basit hücre kültür tahlil geliştirilmiştir. Benzer bir tahlil son zamanlarda mükellef mutasyonların farmakolojik refakatçi terapi (PCT) Fabry hastalığı tanımlamak için preklinik bir test olarak girmiştir. Bu el yazması hızlı fenotipik değerlendirme Fabry ve Pompe hastalığında uygun hastalar için PCT tanımlamak için allelic versiyonlarının ve roman pharmacochaperones gelişmesinde yardımcı olabilir bu bir değişik hücre kültür tahlil açıklar.
Orada glycosidase disfonksiyon birincil gen mutasyonlar sonucu ile ilgili bir düzine Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) üzerinde. Fabry (OMIM #301500) ve Pompe (OMIM #232300) hastalığı, fazla 500 ve 200 missense1,2,3 bildirilmiştir, mutasyonlar sırasıyla hangi toplam mutasyon sayısı yaklaşık % 60 karşılık gelir. Çok sayıda yeni gen değişik hala tespit edilmektedir, birçoğu bilinmeyen var önemi. Geniş biyokimyasal araştırmalar ortaya bazı genotip bir tam kaybı-in-işleve GLA gen yol değil (OMIM * 300644) Fabry hastalığı, ama neden thermodynamically tercih katlama devlet4 ulaşmak başarısız olmasına karşılık gelen enzim . Bu ER saklama ve aksi takdirde fonksiyonel enzim erken bozulma ile sonuçlanır. Benzer sonuçlar Pompe hastalığı5de dahil olmak üzere diğer LSDs çizilmiştir. Ayrıca, enzim değişik moleküler karakterizasyonu mutasyonlar klinik yorumlanması tanı6LSD ilerleme mutasyon niteliğine göre bireysel bir süreç olduğunu düşündüren, zamanında kolaylaştırabilir. Bu nedenle, genellikle 2-3 farklı klinik tipi içine Geleneksel sınıflandırma klinik danışmanlık ve tedavi edici kararlar verimlilik düzeyini artırmak amacıyla yeniden değerlendirmeye.
Enzim replasman tedavisi (ERT) her iki hastalık için kullanılabilir. ERT, ancak, etkilenen doku/organ beyin ve kas iskelet gibi etkinlik sınırlıdır. Ayrıca, ERT terapötik yararları tehlikeye atıyor immünojenik bir yanıt temin. Farmakolojik Chaperones (adet) sözde duyarlı mutasyonlar olan hastalar için bir çekici tedavi alternatiftir. Adet doğru protein katlanması ve endoplazmik retikulum (ER) tutma ve ER ilişkili bozulması enzim sırayla önleyen stabilization için moleküler bir iskele olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, adet sözlü olarak yönetilebilen ve potansiyel olarak kan beyin bariyerini çapraz edebiliyoruz. Bu nedenle, PCT belirli genotip olan hastalar tedavi için daha uygun bir seçenek olabilir. LSDs uygulamada PC üzerinde kapsamlı bir inceleme için mükemmel inceleme Parenti7tarafından bakın.
Mutant gen neden olan hastalık yüzlerce keşfi önceden klinik uyuşturucu testi zorlukları ve mükellef hastalar kişiselleştirilmiş tıp yaklaşım için bir basit, hızlı ve yüksek standart değerlendirme gerektirir. LSD gen mutasyonlarının zararlı etkilerini değerlendirmek amacıyla ve mükellef hastalar için PCT tahmin etmek için aday mutasyon test etmek için hızlı ve güvenilir enzim aktivitesi ölçümü için sağlayan bir yüksek standart aşırı ifade sistem HEK293H hücrelerdeki oldu geliştirdi. Benzer aşırı ifade sistemleri daha önce tarif edilmiş COS-78,9,10,11, HeLa hücreleri12veya HEK293 kullanarak Fabry ve Pompe hastalığı için13 ,14,15,16 hücreleri glycosidase gen için.
Çok benzer bir yöntem bile hastalıkların farmakolojik refakatçi tedaviye yanıt tahmin etmek için bir “yöntemi” olarak patentli bir hücre uygunluğunu gösteren17 kültür sistemi klinik uygulamaya entegre yeteneğine sahip.
Burada açıklanan protokol metabolizma kalıtsal lizozomal hastalıklar enzim hasar değerlendirmesi için sağlam sonuçlar sunar. Bu el yazması bir değişiklik Protokolü önceki15Yayınlanan olduğunu. (Yani, mutant vektör yapı hazırlık sürecinde), sıkılık en önemli değişiklikler içeren hücre kültür Protokolü (örneğin, HEK293H hücre bakım ve transfection koşulları) ve yüksek standardizasyonu (en az 5), son derece sonuçları tekrarlanabilirlik için k…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Mandy Loebert ve Tina Czajka için mükemmel teknik destek kabul etmek istiyorum. Flora Luo (Harvard Tıp Okulu, Boston, MA, ABD) dil düzenleme yardım için teşekkür ederiz.
Material | |||
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
Abbreviations | |||
frw = forward; rev = reverse | |||
n.a. = not applicable |