Этот протокол описывает электрофизиологических оценки мышиных предсердия, используя систему оптического сопоставления с высоким временнóго и пространственного разрешения, включая двойной записи напряжения мембраны и Ca2 + переходных под запрограммирован стимуляция через катетер специализированных электрода.
Недавние исследования генома всей ассоциации, таргетинг предсердий (AF) указали прочная связь между генотипом и электрофизиологические фенотип в предсердия. Это побуждает нас использовать генетически мышиной модели для выяснения механизма AF. Однако трудно оценить электрофизиологических свойств в мышиных предсердия вследствие их малого размера. Этот протокол описывает электрофизиологических оценки предсердия, с использованием системы оптического картирования с высоким временнóго и пространственного разрешения в Langendorff увлажненную мышиных сердцах. Системы оптических картирования собран с двойной высокоскоростной комплементарный металло-оксидный полупроводник камер и высокое увеличение объективов, чтобы обнаружить флуоресценции напряжения чувствительных красителя и Ca2 + индикатор. Сосредоточить внимание на оценке мышиных предсердия, оптические сопоставление выполняется с площадью 2 мм × 2 мм или 10 мм х 10 мм, с 100 × 100 пикселей (20 мкм/пиксель или 100 мкм/пиксель) и дискретизации до 10 кГц (0,1 мс) на максимум. 1-французский размер quadripolar электрод стимуляции катетер помещается в правое предсердие через верхней полой вены во избежание каких-либо механических повреждений в зимнем саду, и ходить стимуляции доставляется через катетер. Электрофизиологическое исследование выполняется с запрограммированной стимуляции, включая постоянной электрокардиостимуляции, ходить, и до тройной extrastimuli ходить. Спонтанное или ходить ритм оптических сопоставления записал потенциал действия продолжительность, активации карты, скорости проведения и Ca2 + переходных индивидуально в правого и левого предсердия. Кроме того запрограммированных стимуляции также определяет inducibility предсердий тахиаритмиями. Точной активации сопоставление выполняется для определения распространения возбуждения в зимнем саду во время индуцированные мерцательная тахиаритмия. Оптическая сопоставления с параметром специализированных позволяет тщательной оценки электрофизиологических атриум в мышиных моделях патологические.
Сердце состоит из 4 камер, в млекопитающих. Верхних двух палат предсердия, и нижние желудочков. Желудочки работает как насос для извлечения системных или легочной циркуляции крови. Предсердия получают кровь, возвращающихся из системного или легочных вен и содействие в перевозке крови в желудочки для получения эффективного сердечного насоса функция. С электрофизиологических аспект важной функцией предсердий является для регулирования сердечного ритма. Электрические сигналы происходят из синусового узла, расположенного на стыке между верхней полой вены (SVC) и правого предсердия (РА), а затем распространить РА и левого предсердия (LA) и проводить желудочка через атриовентрикулярный узел и его Пуркинье проводящей системы.
Аритмии, которые являются нарушения сердечного ритма, подразделяются на предсердий и желудочков в зависимости от их происхождения. Фибрилляция предсердий (AF) является наиболее распространенной формой постоянной аритмии, характеризуется случайным и быстрого возбуждения предсердий. Недавние генетические анализы и исследования генома всей ассоциации (GWAS) показали связь между AF и генетические мутации или monopolymorphisms1,2,3,4. Эти заключения показывают что AF по крайней мере частично связан с генетические причины. Таким образом крайне важно для оценки генотип фенотип взаимодействий в предсердия, с использованием генетически животной модели. Широко признается, что мышь является наиболее авторитетных млекопитающих для генетической модификации.
Методику оптических сопоставления была разработана для оценки возбуждения ткани сердца. Однако наблюдение мышиных Атриум оптических сопоставлением затрудняется его относительно небольшой размер. Мы пытаемся достичь подробную оценку мышиных атриум с высоким временным и пространственным разрешением.
Оптическая сопоставления является устоявшейся маневр для изучения сердечной электрофизиологии7и является весьма полезным инструментом для оценки не только желудочковых аритмий8,9, но также мерцательной10,11 . Одновременное отображение трансмембранного потенциала и Ca2 + транзиентов полезно для понимания основных механизмов аритмии, сердечная недостаточность и другие болезни сердца12,13. При сравнении другие методы электрофизиологических оценки, например, с использованием на одну ячейку или ячейки листа, один из абсолютного превосходства оптических карт в самом перфузии является оценка шаблоне проводимости в нетронутыми атриум и желудочка, не только во время синусовый ритм, но и во время индуцированной аритмий14. Попытка использовать мышиных сердца, особенно Атриум, как суррогат людей трудности главным образом из-за их небольшого размера, однако, мышь является привлекательным экспериментальной модели с точки зрения оценки в генетически животных модель и эта проблема должна быть преодолены. Наш подход обеспечивает в одном направлении, чтобы разрешить его.
Хотя наши оптические сопоставления аппарат был в основном аналогична обычной системой для всей мышиных сердца15, наш метод имеет преимущество оценки мышиных Атриум, сделав некоторые изменения к нему. Во-первых мы стремились добиться высокого пространственного и временного разрешения до 0,1 мс/рама и 20 мкм/пиксель, и это с высоким разрешением сопоставление, способствовали более точное измерение проводимости скорости и распространения шаблона в мышиных атриум. Во-вторых чтобы избежать любого ненужного механических повреждений или растягивать Атриум, который может изменить электрофизиологических свойств 16,17, пребывает игла вводится непосредственно в LV для снижения давления внутри камеры, Вместо вставки через Ла, как в предыдущие исследования15. Кроме того ходить стимула доставляется через катетер пользовательских сделал 1-французский размер электрода помещается в РА, но не иглы электродом, который может травмировать атриум. Любые контакты избегаются при установлении предсердий придаток, которые использовались в прошлом исследования15. В-третьих с точки зрения оценки базового механизма аритмий, запрограммированных стимуляции протокол побудить предсердий тахиаритмиями — решающее значение18,19. Мы выполняем запрограммированных стимуляции идентична в клинических электрофизиологических исследований, включая взрыв ходить и до тройной extrastimuli электрокардиостимуляция, с модификацией ходить интервала для мыши сердца. Таким образом помимо базовых измерений параметров, протокол может оценить inducibility AT. При необходимости, inducibility AT оценивается с администрацией isoproterenol или других наркотиков. По нашему опыту мышах одичал тип вряд ли показать любую САР даже после полной стимуляции протокол. Таким образом inducibility AT должны быть важную информацию для оценки вклада ряда патологических условий, таких как генетические мутации, хирургические вмешательства и отправления наркотиков11. Эти изменения могут оптимизировать точные электрофизиологический оценки в нетронутыми мышиных атриум.
Этот метод также имеет некоторые ограничения. Во-первых, используя максимальное пространственное разрешение с 5 X объектив, поле зрения (FOV) ограничивается частью Атриум (т.е. только левого предсердий придаток, как показано на рисунке 2А). Для получения более крупных ПЗ Атриум, 1.6 X объектив иногда является предпочтительным (рис. 2b). Во-вторых без фиксации атриум с булавками, иногда это трудно измерить предсердий проводимости свойства правильно, потому что предсердная поверхность искривляется. Таким образом мы разместили стекла покрытия на его поверхности, чтобы сгладить это вместо фиксации булавками. Этот метод также полезен для предотвращения артефактов движения от вибрации решения. В-третьих, с нашим методом, это довольно трудно получить весь ПЗ, так, чтобы правильно использовать передний и задний вид более важна в наш подход, чем в другой подход, как показано на рисунке 2. Преимущество спереди бы четкое наблюдение спускаемого в случае патологических состояний, особенно в довесок (рис. 4). С другой стороны представление задняя имеет преимущество получения хорошее представление о мерцательной задней стенки и может быть подробную запись запуска активности миокарда рукав. Когда это трудно получить соответствующее представление и придавить его криволинейной поверхности с нашим методом, Атриум может быть исправлено с минимальным напряжение булавками.
С нашего метода есть 3 возможные проблемы, неудачи окрашивание, ходить, и аритмии индукции. За провал окрашивание, если нет или наблюдается небольшое флуоресценции, вы должны проверить ли оптических сопоставления аппарат правильно смонтирован, и ли реагент надлежащим образом хранится и используется. Состояние перфузии решения также важно, который также может повлиять на электрофизиологических свойств самого сердца, так что, состояние решения, включая рН, температуры, и существует ли достаточно аэрации должна строго контролироваться. Важно также избежать каких-либо воздушных эмболии в самом сердце. Для электрокардиостимуляции провал, если ходить стимулы не возбуждают Атриум, исследователи должны проверить ли проводки правильно с помощью тестера цепи. Когда ходить раздражители правильно выводятся, проблема контакта электродов с ткани. Изменение расположения электродов может решить эту проблему, и наш подход с использованием ходить катетер делает его легко. Трудности в индукции аритмии RV ходить может использоваться для индукции AT в некоторых ограниченных случаях. С помощью quadripolar электрод катетер из которых дистальной двух электродов и проксимальной электроды могут быть расположены в RV и РА, соответственно, это легко изменить ходить сайта от РА для RV. Этот катетер полезен также для смены возбуждения желудочков при одновременной желудочков активации сигнала маски сигнала возбуждения предсердий.
Этот метод будет способствовать оценке генотип фенотип взаимодействий в AF связанных генов, вновь обретенной Роман исследований, таких как GWAS, особенно для генов, с которыми в ходе расследования не показать их на другие подходы. С прогрессом в области приборов и методов электрофизиологические свойства легочной вены рукав, который является важным источником AF20, могут оцениваться в самом нетронутыми с этим подходом.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается программой для совершенствования исследовательской среды для молодых исследователей из специальных фондов координации для поощрения науки и техники (SCF) (для т.с.), дотаций для научных исследований (№ 16K 09494, т.с., № 26293052, для т.ф.) от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) Японии. Мы высоко ценим Brainvision и г-н Кендзи Tsubokura для оказания технической помощи, и мы также признательны г-н Джон Мартин для его языковой помощи.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |