Цель метода, представленные здесь заключается в изучении агрегации белков во время нормального старения в организме модель C. elegans. Протокол представляет собой мощный инструмент для изучения весьма нерастворимых большие компоситы, которые формируют с возрастом и определить, как изменения в proteostasis воздействия агрегации белков.
В последние десятилетия распространенность нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD), выросла. Эти расстройства, связанные с возрастом характерно появление белка агрегатов с фибриллово структурой в мозгах у этих больных. Почему именно обычно растворимые белки проходят процесс агрегации по-прежнему осознаются. Открытие, что агрегации белков не ограничивается процессов болезни и вместо этого частью нормального процесса старения включает изучение молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выразил человека болезни связанных белков. Здесь мы описываем методологии для изучения присущих белка агрегации в Caenorhabditis elegans через взаимодополняющих подходов. Во-первых мы изучим как выращивать большое количество синхронизированы возраст C. elegans для получения возрасте животные и мы представляем биохимическими процедурами изолировать высоко нерастворимые большие компоситы. В сочетании с целенаправленной генетических нокдаун, это позволяет вскрыть роль гена интереса к содействию или предотвращения агрегации белков зависит от возраста с количественного масс-спектрометрии с помощью либо всеобъемлющий анализ или кандидат-анализа на основе с антителами. Затем эти выводы подтверждаются в естественных условиях анализа с трансгенных животных, выражая люминесцентной меткой подверженных агрегации белков. Эти методы должны помочь разъяснить, почему некоторые белки склонны к совокупности с возрастом и, в конечном итоге, как сохранить эти белки полностью функциональной.
Сворачиванию белков и агрегации признаются в качестве отличительной чертой нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как AD, PD, боковой амиотрофический склероз (ALS), frontotemporal деменции (FTD) и многие другие. К примеру α-synuclein сборок в амилоидных фибрилл, накапливаться Леви органов, особенно в Substantia PD больных, в то время как в ALS пациентов TDP-43 или Фу misfold к форме цитоплазматических агрегатов в вырождающихся двигательных нейронов. В каждом из этих нейродегенеративных расстройств механизмы поддержания гомеостаза белка или proteostasis не сможем предотвратить накопление смятых протеинов, следовательно, приводит к болезни.
Proteostasis имеет решающее значение для обеспечения клеточных функций, и в нормальных условиях эти механизмы регулирования плотно контролировать скорость синтеза белка, складные и деградации. Несколько исследований показывают, что с возрастом, постепенно нарушается способность многих клеток и органов сохранить гомеостаз белка и физиологические ухудшение proteostasis сетей с возрастом является важным фактором, усугубляющим нейродегенеративные заболевания (Обзор ссылки1,2,3). Тот факт, что контроль качества белков и клеточного ответа на стресс развернулось белка затрудняется с возрастом свидетельствует о том, что общим следствием старения может быть сворачиванию белков и агрегации. Действительно мы и другие показали, что агрегации белков не ограничивается болезни и вместо этого частью протеома становится весьма моющих средств нерастворимые в возрасте животных4,5,6,7 ,8,9,10. Вычислительные и в естественных условиях анализ показал, что эти физиологических возрастных агрегаты напоминают болезни агрегатов в нескольких аспектах5. Открытие эндогенные, возраст зависимых белков агрегации дает нам возможность вскрыть молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют агрегации белков, без использования ectopically выраженной человеческие белки, связанных заболеваний. В настоящее время о регулировании нерастворимость широко белка и о последствиях этой регуляции на состояние здоровья организма существует лишь ограниченная информация.
Нематоды C. elegans является одним из наиболее подробно изученных модельных организмов в процессе старения исследований, как эти животные имеют относительно короткий срок и показать многие черты характерные старения, наблюдается в высших организмов. Последствия старения на белок нерастворимость в C. elegans , изучен последовательных биохимических фракционирования, на основе дифференциальных растворимость, который широко используется для извлечения болезни агрегатов в области исследований нейродегенеративные11 . Путем количественного масс-спектрометрии стать агрегации подверженных в C. elegans в отсутствие болезни5были показаны несколько сотен белков. Здесь мы подробно описать протокол выращивать большое количество червей в жидкой культуры и последовательное извлечение изолировать агрегированных белков для количественного определения масс-спектрометрии и анализа, Западная помарка. Потому что Протеолиз и подверженных агрегации белков накапливается в возрасте C. elegans гонад и маски изменения в другие соматические ткани5,12,13, мы используем Гонада менее мутант сосредоточиться анализ на белок нерастворимость в не репродуктивных тканях. Представлен метод позволяет анализ высоко нерастворимые, крупных агрегатов, которые нерастворимы в 0,5% SDS и гранулированных относительно низкой скоростью центробежные. Кроме того, был менее строгие протокол извлечения для сбора также меньшие и более растворимые агрегатов опубликованы в другом месте10. Кроме того мы описываем метод, используемый для оценки агрегации в естественных условиях в C. elegans.
В целом эти методы в сочетании с РНК-интерференции (RNAi) можно оценить роль гена интереса к модуляции агрегации белков зависит от возраста. Для этого мы описываем анализ выдержек из молодых и пожилых червей с и без нокдаун специфического протеина интереса, с помощью РНК-интерференции. Эти методы должны быть мощным инструментом, чтобы определить, какие компоненты сети proteostasis регулировать нерастворимость белка. Несколько мероприятий таких как снижение инсулина/инсулин подобный фактор роста (IGF) 1 сигнализации (IIS) показали значительно отсрочить старение C. elegans 14. Долголетие пути часто вызывают механизмов контроля качества протеина и таким образом эти пути могут активно влияющие на уровень агрегации белков. В качестве примера мы демонстрируем снижение присущие белка агрегации в долгоживущих животных при торможении путь IIS7.
Здесь мы приводим методологию для изоляции агрегатов высоко нерастворимого белка от старения C. elegans подвергается РНК-интерференции для анализа по масс-спектрометрии и Западный blotting. Мы покажем, что улучшение proteostasis путем уменьшения IIS значительно препятствует агрегации белков за…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование от DZNE и Мари Кюри международной реинтеграции Грант (322120 D.C.D.)
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
E.coli strain | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |