מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1
Summary
נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.
Abstract
נטרול נוגדנים נגד hemagglutinin (HA) של וירוסים שפעת נחשבים במנגנון החיסון הראשי בקורלציה עם הגנה על דלקות שפעת. מבחני Microneutralization (MN) משמשים לעתים קרובות כדי למדוד את התגובות נוגדן נטרול סרה אנושי לאחר חיסון שפעת או זיהום. תאים Madine דארבי הכלבי הכליה (MDCK) הם המצע תא נפוץ עבור מבחני MN. עם זאת, כעת ומגבלותיהם שפעת A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a וירוסים שרכשו שינו קולטן איגוד ירידה לפרטים. הקו תא MDCK-SIAT1 עם גלקטוז sialic מוגבר של α-2, 6 moieties על פני הוכיחה לספק infectivity משופר, שכפולי נאמן יותר מאשר תאים MDCK המקובלת עבור וירוסים A(H3N2) עכשווי אלה. כאן, אנו מתארים assay MN באמצעות תאים MDCK-SIAT1 זה מוטבה כדי לכמת נטרול titers נוגדנים אלה וירוסים A(H3N2) עכשווי. ב פרוטוקול זה, חום לא פעיל סרה המכיל נוגדנים נטרול הם תחילה באופן סדרתי מדולל, ואז מתפשט 100 TCID50/טוב של שפעת וירוסים A(H3N2) כדי לאפשר נוגדנים ב sera כדי לאגד וירוסים. תאים MDCK-SIAT1 ואז מוסיפים את וירוס-נוגדן, מודגרות במשך 18-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר A(H3N2) וירוסים להדביק תאים MDCK-SIAT1. לאחר דגירה לילה, צלחות קבועים, הכמות של וירוס בכל טוב הוא לכמת על ידי assay מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) באמצעות נגד שפעת נוגדנים חד-שבטיים נוקלאופרוטאין (NP). נטרול כייל נוגדנים מוגדר את הדדיים של הגבוהה ביותר בסרום המספק ≥50% עיכוב של וירוס infectivity.
Introduction
וירוסים שפעת להמשיך לגרום תחלואה ותמותה באוכלוסייה האנושית בכל שנה. חה הוא גליקופרוטאין השטח הגדולות של וירוסים שפעת. נטרול נוגדנים מיקוד HA הן מנגנון החיסון הראשי זה לא מופיע עם הגנה של שפעת זיהום1,2. Hemagglutination עיכוב (איץ ‘ אי) מבחני מבחני MN שתי שיטות בשימוש נרחב כדי למדוד את התגובות נוגדן סרה אנושי לאחר זיהום או חיסון שפעת3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. וזמינותו HI מודד נוגדן עיכוב של וירוס hemagglutination של כדוריות דם אדומות, ונחשב וזמינותו של הפונדקאית. בניגוד HI, וזמינותו MN יכול למדוד ישירות את רמות נוגדנים ב סרה האדם לנטרל השפעת זיהום תרביות תאים. MDCK תאים משמשים לעתים קרובות בבידוד וירוס שפעת, MN מבחני4.
וירוסים שפעת עוברים כל הזמן להיסחף antigenic ו- shift לחוצים, רכישת מוטציות ב- HA חלבונים אשר יכול לשנות יחודיות איגוד קולטן של וירוסים. מאז 2014, אשכולות חדשים של וירוסים A(H3N2) בקע, המשיך לזרום עד העונה הנוכחית. הרוב המכריע של וירוסים אלה שייכים גנטי קבוצה 3C.2a ו- 3C.3a מבוסס על ניתוח פילוגנטי של החלבונים HA. רבים של וירוסים 3C.2a במחזור הייתה ירידה ביכולת hemagglutinate כדוריות דם אדומות, ולכן לא יכול להיות מאופיין על ידי מבחני HI5. ניטרול מבחני יש להשתמש כדי למדוד את תגובות נוגדנים אלה וירוסים לא hemagglutinate6. יתר על כן, מחקרים הראו כי וירוסים A(H3N2) עכשווי אלה שינו המאפיינים איגוד קולטן בהשוואה וירוסים A(H3N2) קודמות, נוטים להצטבר תרבות הותאם מוטציות, פולימורפיזם כאשר passaged בתא במבחנה תרבויות7,8,9. לעומת תאים MDCK המקובלת, MDCK-SIAT1 הוא קו תא שפותחה על ידי. Matrosovich et al. באמצעות תרביות תאים יציב של תאים MDCK עם cDNA של האדם α2, 6-sialtransferase (SIAT1). הקו תא הזה מבטא כמויות גדולות יותר של α2, moieties גלקטוז 6-sialic, ירידה בכמויות של α2, 3-sialic חומצה moieties מאשר ההורה תאים MDCK10. תאים MDCK-SIAT1 הראו לשפר בידוד המחירים עבור וירוסים A(H3N2) לעומת תאים MDCK11. לאחרונה, לין. et al. דיווח כי החדשים המתגלים 3C.2a ו- 3C.3a אנוש A(H3N2) שפעת וירוסים, נאמן יותר שכפולי וירוס, infectivity וירוס טוב יותר הושגו כאשר וירוסים היו בתרבית בשורות תא MDCK-SIAT1, לעומת תאים MDCK7. לפיכך, התאים MDCK-SIAT1 מתאים יותר ב- MN מבחני לאפיון נוגדנים התגובות האשכולות האחרונים של וירוסים A(H3N2).
כאן נתאר וזמינותו MN באמצעות תאים MDCK-SIAT1 כדי למדוד את תגובות נוגדנים 3C.2a עכשווי ווירוסים A(H3N2) 3C.3a של sera אנושי. וירוסים גדל או ביצים או תאים יכולים לשמש זה וזמינותו. חום סרה מוחלש המכיל נוגדנים נטרול תחילה בדילול באופן סדרתי, ואז מתפשט 100 TCID50/טוב של שפעת וירוס A(H3N2) כדי לאפשר נוגדנים ב sera כדי לאגד הוירוס. תאים MDCK-SIAT1 ואז מוסיפים את וירוס-נוגדן, מודגרות במשך 18-20 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר את הוירוס A(H3N2) להדביק תאים MDCK-SIAT1, לשכפל. לאחר דגירה לילה, הלוחיות הן קבועות, הכמות של וירוס היטב כל זה לכמת על ידי אליסה באמצעות נוגדנים חד-שבטיים נגד שפעת A NP. הגילוי של NP מצביע על הנוכחות של זיהום בנגיף ואת העדר נטרול נוגדנים. נטרול כייל נוגדנים מוגדר את הדדיים של הגבוהה ביותר בסרום המספק ≥ 50% עיכוב של וירוס infectivity.
Protocol
Representative Results
Discussion
וזמינותו MN נמנה מבחני העיקריים המשמשים עבור שפעת סרולוגיה לזיהוי נוגדנים תגובות בעקבות שפעת זיהום או חיסון. Titers שנוצר מתוך מבחני MN משמשים לעתים קרובות התוצאה העיקרית של מחקרים רבים של seroepidemiology שפעת. מבחני MN נמצאים בשימוש נרחב גם sero-אבחון, הערכת חיסון immunogenicity. מחקרי מעבדה אינטר בינלאומיים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לו Xiuhua ד ר ד ר פנג Liu, מיס אשלי. בורוז ממחלקת שפעת של ה-CDC ביקורת, סיוע בהכנה של כתב היד הזה. אנו מודים ד ר אדריאן Reber ממחלקת שפעת של ה-CDC על סיועו בהכנת הגרפיקה של איור 3. לבסוף, אנו מודים ד ר מ’ Matrosovich, מרבורג שבגרמניה למתן את התאים MDCK-SIAT1.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
