כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.
כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.
ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.
ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.
תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.
הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה “rbd” כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.
התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף “all-or-none”, להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.
חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.
בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.
פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.
תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.
השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגוב?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.
Reagents | |||
Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials and Equipment | |||
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |