액체 및 셀의 높은 처리량 차가운 실제 플라즈마 치료 프로토콜 표시 됩니다. 플라즈마 처리 후 플라즈마의 방출 스펙트럼, 액체 및 세포 활동의 후속 분석 측정 다른 피드 가스 플라즈마 점화에 대 한 구성 설정 포함 됩니다.
플라즈마 의학, 척추 시스템의 주변 온도와 이온된 가스는 세포와 조직에 적용 됩니다. 콜드 플라즈마 생성 반응 종 redox 알려진 조절 건강 및 질병에 생물학 과정. 전 임상 및 임상 증거는 피부의 만성 궤 양 치유에 플라즈마 처리의 유익한 효과를 가리킵니다. 플라즈마 암 치료 등 다른 신흥 주제 증가 관심을 받고 있다. 플라즈마 의료 연구는 물리학, 화학, 및 의학 분야 전문 지식을 필요합니다. 플라즈마 연구의 한 목표는 특정 응용 프로그램의 다양 한 플라즈마 처리 셀의 특성입니다. 이 포함, 예를 들어 세포 수 그리고 생존, 세포질 산화, 미토 콘 드리 아 활동, 세포 독성 및 세포 죽음, 세포 주기 분석의 세포 표면 마커 식 및 cytokine 릴리스. 이 연구는 필수 장비와 같은 플라즈마 생물 의학 연구에 필요한 워크플로 설명 합니다. 대기 압력 아르곤 플라즈마 제트, 특히 그것의 기본적인 방출 스펙트럼 모니터링 및 먹이 반응 종 출력 변조 하 가스 설정의 적절 한 작업을 설명 합니다. 높은 정밀 xyz 테이블 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여, 제트기는 맴돌고 밀리초 정밀도에서 최대한 재현성에 대 한 마이크로 미터-정밀에서 96 잘 접시의 구멍. 산화 환 원 활동적인 분자의 액체 분석에 대 한 다운스트림 분석 표시 되 고 대상 셀은 플라즈마 처리. 특히, 흑색 종 세포 동일한 셀을 사용 하 여 다른 연속 분석 실험의 효율적인 순서로 분석: 신진 대사 활동, 총 셀 영역, 그리고 calreticulin에 대 한 중요 한 분자의 표면 마커 식의 측정은 암 세포의 면역성 세포 죽음입니다. 이 분석 실험 단일 플레이트에서 플라즈마 효과 대 한 내용이 풍부한 생물 정보를 검색합니다. 이 연구 필수 단계 및 플라즈마 의료 연구에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
반응 종은 비정상적인 상처1 과 암 치유를 포함 하 여 질병에 중요 한 산화 환 원 레 귤 레이 터 이다입니다. 2 중요 한 것은, 이러한 종 병 리 뿐만 아니라 그것의 치료 해결책에서 포함 된다. 3 , 4 찬 실제 플라즈마는 많은 종류의 반응 종 퇴 학 시켜도 이온화 가스 이다. 5 신체 온도6에서 작동 하는 소위 냉 플라스마의 출현 이후 차가운 플라스마 세포와 열 피해 없이 조직에 적용할 수 있습니다. 효능과 전 임상 및 임상 관찰에서 플라즈마 장치 안전 응용 프로그램으로, 3 독일에서 의료 기기로 인증을 받았습니다. 7 차적인 안전에 관해서는 특히 여러 연구 나타났습니다 최초의 장치, 대기압 아르곤 플라즈마 제트를 사용 하 여 돌연변이 이벤트의 부재. 8 , 9 , 10 다른 두 장치는 플라즈마 제트 보다 다른 원리를 통해 작동 하는 소위 유 전체 장벽 방전 (DBD)입니다. 특히, 제트기 DBD 플라즈마는 큰 하지만 오히려 평면 조직 영역에서 효율적인 반면 메스 같은 표면 및 충 치의 치료에 대 한 허용. 세포질 산화 환 원 신호11을 이용, 기술은의 목적은 생명 의학 어플리케이션에 대 한 플라즈마 생성 반응 종 활용 하입니다. 12 임상 플라즈마 치료의 특히 유망한 응용 상처 치유의 지원 이다. 13 , 14 , 15 또한, 플라즈마 표시 했다 동물 모델에서 항 암 효과가지고. 16 , 17 , 18
동물 모델, 또는 심지어 인간에서 플라즈마 응용의 안전과 효능 검증, 생체 외에서 연구 해야 플라즈마 장치 실시를 표준화. 이 실험은 플라즈마 응용 프로그램을 탐구 하 고 직장에서 메커니즘의 윤곽을 그리 다 필수적 이다. 또한, 기초 연구 반응 종 및 후속 생물학적 효과의 구성의 영향을 이해 하는 것 필요 합니다. 이 연구에서는 플라즈마 생물 의학 연구를 더 잘 이해 하 고 세포에 미치는 영향을 제어 통합할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 그것은 피드 가스 조성, 반응 종 출력의 모니터링, 액체, 셀, 및 조직, 및 결과 화학 및 생물 학적 결과 플라즈마의 응용 프로그램 튜닝을 설명 합니다. 또한, 예제는 플라즈마 96 잘 접시에 의료 연구에 중점을 두고 플라즈마 처리 및 다운스트림 생물학 분석 실험의 표준화에 지시 제공 됩니다. 이 접근은 뚜렷한 장점: 나) 셀 필요 조건, 시 약 비용, 시간과 실습 샘플; 당 당 수의 최소화 ii) 당의 중복 또는 triplicate 치료; 쉽게 설정할 수 있습니다 결과의 높은 정확도 그리고 iii) 원활한 다운스트림 시 금 96 잘 형식 플레이트 리더, 이미징, 및 교류 cytometry 실험의 촉진.
기초 연구의 효능 및 전 임상 및 임상 연구에 플라즈마 의학 underpinning 메커니즘의 이해를 개발 하기 위한 기본적 이다. 기초 연구는 또한 치료에 대 한 새로운 응용 프로그램의 수사를 승진 시킨다. 잘 설립 플라즈마 반응 산소 및 질소 종19의 세대를 통해 그들의 생물학적 효과 중재, 거기은 여전히 필드에 세 가지 주요 과제입니다. 첫째, 어떤 종은 중요 한? 이 부분적으로 광학 진단 및 생물 학적 판독 플라즈마의 피드 가스 조성 변조 하 여 응답 될 수 있다. 20 두 번째, 어떤 효과에서 볼 수 있습니다 세포 등 생물학적 목표? 이것은, 적어도 부분적으로, 세포 배양 실험 및 다양 한 분석 실험을 사용 하 여 해결 되었습니다. 진 핵 세포에서 효과 지원 뿐만 아니라 다 면 발현 성 등 세포 주기 검거21, apoptosis22, 괴 사23, 그리고 피부 세포 자극24,,2526또는 세포의 감소 운동 성 또는 대사 활동27,,2829. 이러한 다 면 발현 성 효과에 관련 된 세 번째 도전, 종종 다른 세포 유형에서 본 다양 한 효과 설명 하기 위해 플라즈마 파생 oxidants에 세포질 응답을 결정 하는 주요 분자를 식별 하는 것입니다. 이 행 해질 수 있다 omics 기술을30,,3132 에 의해 및 최대 또는 downregulation의 siRNA (redox) 억제제, 항 산화 및 항 산화 효소, 뿐만 아니라의 변조 신호를 사용 하 여 대상 유전자는 플라즈마의 반응 종 출력입니다. 33 , 34 , 35 따라서, 유선형된 분석 결과 프로토콜 필요 반복의 많은 함께 큰 샘플 세트를 테스트 합니다.
이 연구는 상기 과제에 관해서는 플라즈마 의료 연구를 위한 생물학, 물리학에서 효율적인 실험 워크플로 예로 보여주. 플라즈마 소스 및 플라즈마 생성의 엔지니어링 측면에 대 한 내용은 전에 설명 했습니다. 36 , 37 , 38 이 분석 실험의 모든는 다양 한 장점 96well 접시에서 수행 됩니다. 예를 들어, 셀 문화 supernatants 같은 샘플 수행할 수 있습니다 쉽게 분석 결과에서 조사, 예를 들어 효소 연결 된 immunosorbent 분석을 통해 단백질 농도를 컬렉션 판. 96-웰 스에서 직접 읽을 수 있는 과학적인 장비를 사용할 수 있는 경우 이러한 접근 방식은 샘플 및 handsontime 당 비용을 최소화 하 고 동일한 샘플에서 다른 분석 실험을 다중화 하 여 결과 최대화. 멀티 채널의 사용 펫 또한 샘플 처리 속도. 원칙적으로, 여기서 설명 하는 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 밖으로 더 큰 잘 직경, 잘 플레이트 형식을 사용 하 여 다른 튜브와 다운스트림 분석 실험에 대 한 선박으로 추가 pipetting 단계가 필요 하지만. 그러나 384well 접시, 작은 접시 유형, 큰 피드 가스 용으로 제트기를 사용 하 여 생물 플라즈마 연구에 적합 한 형상을 표시 하지 않습니다. 특히, 그것만 단일 하지만 하지 인접 한 웰 스는 치료 하는 동안 영향을 보장할 수 없습니다.
액체 분석 종 증 착은 플라즈마에 의해 조사 필수적입니다. 전문가 분석, 다른 분석 실험의 병렬 설치는 동시에 다른 산화 제에 관해서는 plasmatreated 액체 특징 수 있습니다. 이 다중화 plasmaderived 종의 차별화 된 사진을 개발 수 있습니다. 설명 방식은 매우 민감한 과산화 수소 농도39, 조사는 종종 필요 하지만 항상 플라즈마 효과 설명 하기 위해 충분 하지. 40 , 41 , 42 생물학 관련 효과 수 있습니다 또한 부과 액체에 glutathione 분석 여기에 포함 되지 않습니다와 함께. 43 특정 아 질산염 분석 결과 좋습니다 기존 Griess 분석 10fold 분석 결과 고감도 (데이터 표시 되지 않음) 때문에. Plasmatreated 액체 hypochlorous acid DTNB 분석 결과 사용 하 여의 형성에 대 한 조사도 수 있습니다. 그러나, 이전 결과 우리의 플라즈마 소스와 그 종 형성을 나타내지 않았다. 19 , 39 , 44 플라즈마 처리 완료 된 후 종 악화가 일어난다 시간이 지남에. 아 질산염 질산염;에 반응 또한, 과산화 수소는 시간이 지남에 따라 소모 됩니다. 그러나, 이러한 프로세스는 몇 시간이 걸릴. 35 시 토 크롬 c 흡수 뿐만 아니라 몇 시간 동안 안정적입니다. 따라서, 프로세스 처리 후 첫 30 분 이내 발생 하는 경우 여기에 설명 된 오래 된 종의 농도에 변화 무시할 수 있습니다. 그러나, 주의 해야 한다 90% 과산화 수소 1 h (데이터 표시 되지 않음) 내에 최대 청소 수 있는 성분으로 특정 종류의 미디어 (예를 들어, Dulbecco의 수정이 글 매체) 조사 때 플라즈마 과산화 수소 증 착에의 한 과소로 이어지는 액체입니다.
멀티플렉스 분석 결과 세포 표면 마커 식 신진 대사 활동을 조사 하 고 셀 영역 (형태)에서 범위를 제공 됩니다. 이 분석 실험의 조합 흥미로운 결과 공개 수 있습니다. 예를 들어 우리는 이전에 표시 THP1 monocytes 대사 활동 및 셀 수 플라즈마에 노출 다음 선형 패션에서 감소 하지 않습니다. 플라즈마 처리 시간을 증가 함께 45 래더 셀 크기에서 증가 했다 고 따라서 높은 신진 대사 속도를 percell으로 이어지는 높은 미토 콘 드 리아 질량을 했다 관찰 했다. 기본적으로, 조합의 여러 리더, 현미경, cytometry 멀티플렉싱 세포질 응답 다음 플라즈마 처리에 대 한 정보. 흑색 종 세포에 우리 여기에 초점을 세포 독성 효과 calreticulin에 의해 중재 그들의 immunogenicity. 46 으로 다른 많은 질문 이미징 및 흐름 cytometry 결과 함께 신진 대사 활동을 연결 하는이 방법을 해결할 수 있습니다. 예를 들어 세포 분화 (예: macrophage 분극), 미토 콘 드 리아 멤브레인 전위, 세포 주기 분석, 세포 운동 성, 역학, 또는 genotoxicity의 분석에 대 한 micronucleus 형성 수 있습니다 또한 조사에 플라즈마 처리 셀입니다. 다 색 cytometry 동시에 다른 세포 인구에서 더 많은 응용 프로그램에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 신호 녹음 방송 요인, mRNA 정량화, 세포내 cytokines의 측정 및 평가 총 감소 thiols 단일 세포 수준에서의 단백질의 인 산화 상태에 대 한 분석이 포함 됩니다. 각 샘플에 사용할 수 있는 추가 생물학 관련 정보 현재와 미래의 플라즈마 응용 프로그램을 이해 하기 더 플라즈마 산화 환 원 효과의 그림을 개발에 에이즈.
The authors have nothing to disclose.
독일 연방 교육부 및 연구 자금 (BMBF 부여 번호 03Z22DN11 및 03Z22DN12)은 기꺼이 인정 했다.
accutase | BioLegend | 423201 | |
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
argon gas | Air Liquide | N50 | |
B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
catalase | Sigma | C30 | |
cell culture incubator | Binder | CB210 | |
cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
Glutamine | Sigma | G7513 | |
imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
mass flow controller | MKS | G-series | |
Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
plate reader | Tecan | M200pro | |
propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
resazurin | VWR | B21187.06 | |
RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |