نقدم أساليب لتقييم قدرة متجولة الضامة مورين الأولية المشتقة من نخاع العظم استخدام الحطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين وتلطيخ الحبرية داخل الخلايا الدهنية.
المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) هي الكريات البيضاء الناضجة التي تخدم دور حاسم فسيولوجية البالعات المهنية قادرة على مسح مجموعة متنوعة من الجسيمات. عادة، يتم تقييد بمدمس من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ولكن بعد إصابة، سهولة التسلل. مرة واحدة داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي المصابين، بمدمس هي نوع الخلية الابتدائية المسؤولة عن الإزالة الحطام الخلوية المستمدة من الأذى، بما في ذلك كميات كبيرة من الحطام المايلين الغنية الدهن. تداعيات لاثيل بمدم التسلل والمايلين البلعمه الحطام داخل الجهاز العصبي المركزي معقدة وليست مفهومة جيدا. تسمح البروتوكولات المذكورة هنا، لدراسة مباشرة في المختبر من بمدمس في سياق إصابة الجهاز العصبي المركزي. نحن تغطي مورين بمدم العزلة والثقافة وإعداد الحطام المايلين، وفحوصات لتقييم بمدم المايلين الحطام البلعمه. هذه التقنيات إلى نتائج قابلة للقياس الكمي قوية دون الحاجة إلى معدات متخصصة هامة أو المواد، ولكن يمكن تخصيصها بسهولة لتلبية احتياجات الباحثين.
المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) حلقة وصل هامة بين نظم المناعة الفطرية والتكيف. مستضد تقديم الخلايا (Apc)، يمكنهم الاتصال مع الخلايا الليمفاوية عن طريق عرض كل مستضد وسيتوكين الإصدار1،،من23. ومع ذلك، وظيفتها الأساسية البالعات المهنية، لمسح مسببات الأمراض، والذين تتراوح أعمارهم بين الخلايا والحطام الخلوية1،4. بعد إصابة حبل الشوكي (علوم)، يتم إنشاء كميات كبيرة من الحطام المايلين من oligodendrocytes يحتضر، نوع الخلية مسؤولة عن الجهاز العصبي المركزي إكسون مييلينيشن5. نحن وآخرون أظهرت أن إزالة الحطام المايلين تقع أساسا على عاتق من التسلل إلى بمدمس5،،من67. ومع ذلك، ضمن إصابات النخاع الشوكي قد اقترح الإحاطة مواقع الحطام المايلين إزاحة هذه الخلايا للالتهابات عادة نحو8،5،دولة برو تحريضية9. وتعتبر بمدمس الوسطاء الرئيسيون لالتهاب الأعصاب في الحبل الشوكي المصاب، أهداف السريرية الهامة.
للمساعدة في التحقيق في تأثير بمدمس في الحبل الشوكي المصاب، قمنا بتطوير نموذج في المختبر لمباشرة دراسة كيفية الاستجابة بمدمس للحطام المايلين. تحسين أهمية بيولوجية، تستخدم كل من بمدمس مورين الأولية والحطام المايلين طازجة معزولة في هذه التحقيقات. على هذا النحو، بالتفصيل الأساليب المعروضة هنا أيضا بالعزلة وثقافة بمدمس موريني الأولية، وأسلوب تدرج سكروز معدلة المستخدمة لعزل الجهاز العصبي المركزي موريني المستمدة المايلين الحطام10،،من1112. الحطام المايلين يمكن أن توصف بسهولة مع صبغة فلورسنت، إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE)، إلى المسار في استيعاب بمدمس. كفسي هو مناسبة تماما لهذا التطبيق لأنه غير-السامة للخلايا، ولها تصاريح الطيف الفلورسنت ضيقة الإرسال المتعدد مع غيرها الفلورسنت يسبر13،14. بعد البلعمه، تنقل عن طريق ليسوسوميس الدهون الحطام المايلين والمعلبة كمحايد الدهون داخل الخلايا الدهنية قطرات5. لتحديد مقدار هذا التراكم داخل الخلايا الدهنية، نقدم النفط الأحمر يا (أورو) تلطيخ الأسلوب الأمثل لتحليل الصورة الكمية. ينتج هذا الأسلوب المصبوغة بسيطة النتائج استنساخه قوية وتقدير حجم15. هذه الطرق تسهيل دراسة الحطام المايلين البلعمه والدهن الاحتفاظ مع محدودية المعدات المتخصصة.
استخدام الإجراءات المذكورة هنا CNS الخام الطازج معزولة المايلين الحطام والضامة الأولية المستمدة من نخاع العظام. لتقليل النفقات الحيوانية، نوصي بأن كلا العقول وأن تحصد خلايا نخاع العظام من كل الماوس في وقت التضحية. ويمكن إعداد اثنين من الباحثين يعملون معا كل من المواد في نفس الوقت. وبدلاً م…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يود أن يشكر جلين سانغر-هودجسون، “أخصائي وسائط الإعلام” في “كلية طب الاتحاد السوفياتي السابق” لكل عمله في إنتاج الفيديو وتحريرها والتعليق الصوتي.
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (R01GM100474 و R01GM072611).
DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
Equipment | |||
Materials | Company | Catalog Number | Comments |
Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |