Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.
Mondelinge biofilm en haar moleculaire analyse vormen een basis voor het onderzoeken van verschillende tandheelkundige onderzoek en klinische vragen. Kennis van biofilm samenstelling leidt tot een beter inzicht in de mechanismen van verwekkende en periopathogenic. Microbiële veranderingen die plaatsvinden in de mondholte tijdens de kindertijd zijn interessant om verscheidene redenen. De evolutie van het kind mondelinge microbiota en verschuivingen in de samenstelling moet verder worden geanalyseerd om te begrijpen en eventueel voorkomen dat het begin van de ziekte. Op hetzelfde moment, is geavanceerde kennis van de natuurlijke samenstelling van mondelinge biofilm nodig. Vroege stadia van cariës-gratis permanent gebit met gezond tandvlees bieden een algemeen onaangetast subgingivale habitat die als een basislijn in situ dienen kan voor het bestuderen van functies van mondelinge gezondheid en ziekte. Analyse van de mondelinge biofilm kinderen tijdens de verschillende fasen in het leven is dus een belangrijk thema in het veld. Moderne moleculaire analysemethoden bieden uitgebreide informatie over de bacteriële diversiteit van dergelijke biofilms. Opdat de microbiota gegevens vergelijking, is het belangrijk om te standaardiseren van elke stap in de procedure voor moleculaire gegevens generatie. Deze procedure omvat van klinische steekproeven, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic gegevensverwerking, taxonomische interpretatie. Een van de meest cruciale factoren hier is de biofilm bemonstering. Bemonstering bij kinderen is dat zelfs meer uitdagend, met name als gevolg van de beperkte ruimte in de subgingivale gebieden. Dus richten we ons op het gebruik van papier punten voor subgingivale bemonstering. Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor mondelinge biofilm bemonstering van de subgingivale Sulcus (hersenanatomie), de mucosa en speeksel bij kinderen.
Menselijke mondelinge biofilm omvat een brede gemeenschap die bestaat voornamelijk uit commensals en gunstige micro-organismen1,2,3. Soorten die hier voorkomen koloniseren alle niches dat de mondholte4,5,6 biedt. Biofilm samenstelling in deze nissen varieert zo breed als de habitats. Speeksel weergeeft, bijvoorbeeld verschillende bacteriële profielen dan plaque monsters. In plaque monsters van gezonde volwassenen is de relatieve overvloed van Straalzwammen meer dan 20%, terwijl minder dan 7% is gevonden in het speeksel. Bacteroidetes en Firmicutes verschijnen in tegenstelling in veel hogere aantallen in speeksel7. Het is dus belangrijk om te monster op verschillende locaties in de mond om het hele beeld. Bovendien maken verschillende factoren zoals de geografische en etnische verschillen, leeftijd, geslacht, en vele andere factoren het moeilijk om algemene regels voor de biofilm ontwikkeling en ziekte begin8,9te identificeren. Het onderzoek van periopathogenic en verwekkende biofilm is al vele jaren een centraal aandachtspunt8,10,11,12,13.
In de afgelopen jaren heeft onderzoek naar gezonde proefpersonen opgedaan belang niet alleen voor een breder begrip van ziekte, maar ook voor de uitvoering van de preventiemaatregelen14. Nieuwe technologieën en moleculaire analyses verder toelichten mondelinge biofilm vorming en functie15,16, en inschakelen het volledige profilering van microbiële diversiteit17,18. Naar verwachting zal ook leiden tot een nieuw begrip van microbiële wijzigingen tijdens orthodontische therapie19. Een impact op de ontwikkeling van orthodontische biomaterialen is te verwachten. De verbeterde vooruitzichten zal werpen nieuw licht op complicaties van orthodontische therapie biofilm, zoals emaille demineralisatie en parodontale ziekten12,20,21is gekoppeld. Als u wilt toestaan dat wereldwijd gegevens vergelijkingen, is het van cruciaal belang om te standaardiseren van alle stappen in de generatie van de gegevens. Kleine wijzigingen in de procedures van het laboratorium kunnen de resultaten sterk beïnvloeden. Bovendien is het gebruik van verschillende computationele platformen in de verwerking van gegevens kan leiden tot niet-vergelijkbare datasets. Ten slotte, de keuze van de statistische tests en correcties heeft een invloed op de resultaten. Echter, sampling bias al lang voordat de wijzigingen van de lab kan optreden of bio-demand begint. Niet-gestandaardiseerde bemonsteringsmethoden leiden tot een inherent partijdig studie. Met het oog op lage tot gematigde niveaus van normalisatie in de relevante studies bestaat weinig bewijs over de relatie tussen orthodontie en microbiomes19. Daarom zou de ontwikkeling van gestandaardiseerde methoden vergemakkelijken gekwalificeerde vergelijking van gegevens in het veld.
Dit artikel presenteert gestandaardiseerde mondelinge biofilm bemonsteringsprocedures. Het protocol beoogt bij te dragen aan het genereren van globaal vergelijkbare collecties van microbiële sequencedata. Een stapsgewijze protocol voor mondelinge biofilm bemonstering bij gezonde kinderen wordt gepresenteerd. Als de methode van keuze zijn papier punten ingevoegde atraumatically in de correcte subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Om te vergemakkelijken habitat vergelijkingen, Wang mucosa bemonsterd volgens hetzelfde protocol. Dit artikel demonstreert bovendien parallelle en gegroepeerde bemonstering. Bovendien, de bemonstering van het speeksel is aangetoond. Een eenvoudige vergelijkende vervoer en opslagsysteem wordt ook gepresenteerd, vergemakkelijking van het beheer van het specimen voor verdere verwerking. De keuze van de stroomafwaartse activiteiten met betrekking tot opslagmedium, metagenomic analyses, en bio-informatica, hangt af van de klinische vragen van verschillende velden in mondelinge onderzoek. In dit manuscript, DNA bemonstering voor NGS uitgekozen als voorbeeld van een mogelijke toepassing voor orthodontische onderzoek.
Bacteriën zijn te vinden op alle sites binnen de mondholte24,25,26. Vele studies hebben gericht op het gebruik van speeksel als een medium van de bemonstering voor de kaart van mondelinge kolonisatie, aangezien het kan gemakkelijk worden bemonsterd door het spugen27,28,29,30,31, 32. Speeksel biofilm weerspiegelt echter niet subgingivale biofilm samenstelling. Dus, het gebruik van andere bemonsteringsmethoden is van cruciaal belang voor het maken van het geheel, en nieuwe discussies in tandheelkundige onderzoek zal oproepen. Verschillende artikelen vergelijken met het gebruik van Curettes| en papier punten voor subgingivale bemonstering van periodontally zieke onderwerpen8,33,34. Nog is geen onderzoeksgroep bekend te hebben gericht op de toepassing van gestandaardiseerde bemonstering apparaten voor verschillende leeftijdsgroepen, met name voor kinderen,19.
In deze video, wordt mondelinge biofilm bemonstering van drie mondeling habitats bij gezonde kinderen gepresenteerd.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Het doel van het manuscript richt zich op het protocol voor klinische voor subgingivale biofilm bemonstering van gezonde kinderen. De methode van keuze verwijst naar geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) waar beperkte ruimte maakt bemonstering vooral uitdagend. In deze video werd de methode toegepast op vroege permanent gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit, en aan kinderen en/of volwassenen. Onze bemonsteringsmethode zorgt voor wijzigingen zoals één of samengevoegde monsters. Deze instelling kan worden een cruciale factor voor moleculair analyses als gevolg van de kleine hoeveelheid DNA collectable van de gezonde subgingivale Sulcus (hersenanatomie). De keuze van de tanden van de index kan worden gewijzigd op verzoek; in het bijzonder kunnen een andere tand bemonsterde als alternatief wanneer het epithelium is getraumatiseerd en bloeden, waardoor het papier punt onbruikbaar zijn. Parallelle bemonstering twee papier punten tegelijk op één site te gebruiken maakt monster replicaat-organismen in één stap, naast het verkorten van de tijd van de stoel voor kinderen.
Met kleine aanpassingen kunnen zieke paradontale pockets worden bemonsterd. Hier zal papier punten moeten worden opgenomen in de volledige lengte van de zak, die tot 10 mm oplopen kan. De lengte en de conus van papier punten en de diepte van de invoegpositie moet worden aangepast aan de intraoral habitat van belang, maar moet altijd worden gestandaardiseerd door materiaal en afmetingen. Monsters kunnen ook worden genomen vanaf de mucosa met behulp van papier punten. Identieke protocollen toestaan vergelijkingen van verschillende mondelinge habitats en diverse tandheelkundige materialen. Patiënt voorbereiding en monster-opslag kunnen worden uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Voor metatranscriptome onderzoek, kan RNA worden bemonsterd met dezelfde methode. Dus, na de monsterneming, de papier-punten moeten worden opgenomen rechtstreeks in RNA stabilisatie oplossing.
Beperkingen van de techniek:
Ongeacht wijzigingen is de klinische bemonsteringsmethode we beschrijven beperkt tot het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Andere bemonsteringsplaatsen, wat betreft de periodontally zieke zakken voorbeeld, uitmaakten geen deel van ons studie-ontwerp. Als bemonstering tot de volledige diepte van dergelijke zakken nodig is, is het mogelijk dat papier punten niet groot genoeg is voor het verzamelen van monsters voldoende worden. Als de experimentele doel is om gegevens bemonsterd van geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) en periodontally zieke zakken te vergelijken, is het belangrijk om te beseffen van de inherente bias die is gekoppeld aan verschillende klinische bemonsteringsmethoden. Het is daarom niet aan te raden om dergelijke gegevens te vergelijken.
Een beperking van de methode die hier gepresenteerd is bemonstering zonder het latere gebruik van propidium monoazide. Het toevoegen van deze agent direct na de monsterneming voorziet in specifieke analyse van alleen de levende cellen in de biofilm geanalyseerd. De hier beschreven methode van monsterneming weerspiegelt aantallen levende en dode cellen. Voor het onderzoek van ernstige parodontitis, zal papier punten waarschijnlijk moeten worden vervangen door Curettes|, zoals biofilm vorming in diepe zakken sterk is. Papieren punt bemonstering mogelijk niet overeen met het gehele microbiële spectrum in deze gevallen, als hun oppervlak kan te snel worden verzadigd.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Het voorgestelde manuscript is de eerste in zijn soort op de standaardisering van subgingivale bemonstering in de gezonde Sulcus (hersenanatomie) met papier punten. Andere verslagen hebben verwezen naar het gebruik van metalen Curettes|35,36 of papier punten 37,38,39, maar niet beschrijven de processen die vóór de bemonstering plaatsvinden, dergelijke Als de plaque control, tand schoonmaken, tand isolatie en drogen, evenals de processen die voortvloeien uit de ontoereikende specificaties op de bemonsteringsleidingen techniek en tijd.
In de twee vorige artikelen, laten we zien dat het gebruik van papier punten een reproduceerbare methode voor subgingivale biofilm bemonstering in kinderen22,40 is. Als gevolg van hun ontwerp zijn Curettes| te groot voor de ondiepe Sulcus (hersenanatomie) met beperkte ruimte en te scherp voor de aanbesteding regulates epitheel. Het is van cruciaal belang voor toegang tot de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) zonder het epithelium traumatiserend. Op deze manier wordt bias die voortvloeien uit het bloeden vermeden. Het gebruik van de punten slank en teder papier is dus voor dit gebied de voorkeur. Papier punten zijn functioneel om te controleren van wijzigingen in de samenstelling van de biofilm tijdens orthodontische behandeling21,41. Ze zijn slank en flexibel genoeg om te passen tussen de elementen van vaste orthodontische apparaten. Dit is een groot voordeel naar andere bemonsteringsmethoden zoals Curettes|. Atraumatische bemonstering wordt vereenvoudigd en bemonstering van kleine hoeveelheden DNA is mogelijk.
Toekomstige toepassingen:
In deze video toonden we de methode van permanente, niet-zieke, vroege gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit. Met enkele aanpassingen is het mogelijk om te proeven van periodontally zieke sites zoals tanden of implantaten en andere niches als gevolg van tandheelkundige materialen door hetzelfde protocol te volgen. Cariës onderzoek kon profiteren van dit gestandaardiseerde protocol, in bijzondere studies op wortel cariës. De belangrijkste les van onze monster video is standaardisatie van de protocollen gegevens om vergelijkbaar te maken, geen kwestie wat en hoe monsters worden gemeten.Toekomstige video demonstraties kunnen het veld van klinische bemonstering in het algemeen verbeteren.
Mondelinge biofilm verkregen zoals in de video wordt gebruikt in klinieken en voor wetenschappelijk onderzoek. Deze aanpak in vivo vormt een goede aanvulling op in vitro moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie15. NGS methoden, toestaan toegepast op de verzamelde biofilm, als de pyrosequencing die hier is afgebeeld, de analyse van de volledige microbiota. Berekening van de relatieve abundanties van bepaalde bacteriesoorten kan worden gebruikt ter ondersteuning van behandelingen of om andere patiënten of verschillende behandelingen te vergelijken. Samen met een gestandaardiseerde sequencing protocol en sequentie analyse workflow hebben wij eerder beschreven40, deze bemonsteringsmethode kunt sequentieanalyse tot op het niveau van het geslacht. Verder “meta”-studies zoals metatranscriptomic of metabolomic studies zijn mogelijk gebaseerd zijn op het protocol van de bemonstering gepresenteerd in deze video.
Kritische stappen:
Vermijden van vervuiling is een cruciale stap: steriele instrumenten moeten worden toegepast in een omgeving met niet-steriele in vivo . De overdracht van de mond naar de Bank moet snel en veilig worden uitgevoerd door een ervaren onderzoeker stoel tijd voor studiedeelnemers zo kort mogelijk houden. De meest kritische stap in het protocol is de atraumatische invoeging van het punt van het papier in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Verstoring van de regulates epitheel en bloeden absoluut moeten worden vermeden. Verdere zorg moet worden genomen om niet besmetten papier punten en opslag flesjes met exogene DNA of RNA. De opslag zelf dan ook is een cruciale stap. Monsters moeten worden bevroren rechtstreeks, op zijn best bij −80 ° C. Dit voorkomt veranderingen in bacteriële samenstelling post steekproeven, die rangschikkend resultaten vervalsen zou.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn Joachim Theussl (centrum voor medisch onderzoek, medische universiteit van Graz) dankbaar voor de uitstekende technische bijstand in de videoproductie en Monica Farrell (onderzoekmanagement, medische universiteit van Graz) als stem talent.
Paper Points Taper .02, sterilised | VDW Dental | 550 029 015 | http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2 |
GC Cocoa Butter, Tube of 10 g | GC EUROPE N.V. | 000387 | http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22 |
Rondells blue | DIRECTA AB | Rondell Tablets | http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767 |
Great Lakes Nola Dry Field System | Great Lakes Ortho | 300-401 | http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626 |
tooth brush | Oral-B | http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro | |
micro-Ident plus11 | Hain Lifescience GmbH | 23312 | http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html |
ParoCheck | Greiner Bio One International GmbH | 460020 | https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/ |
Carpegen Perio Diagnostik | Carpegen GmbH | http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html | |
tubes Reaktionsgefäße 1,5 ml | Lactan | CH77.1 to CH81.1 | www.lactan |
cotton swabs | Henry Schein | 9003182 | www.henryschein.at |