여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.
(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl– 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.
Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막1내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis2의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.
세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강3악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상4. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC5에 대 한 치료를 개선할 수 있습니다. 수많은 생물 학적 프로세스를 포함 하는 이온 채널 다른 암6의 개발에 중요 한 역할을 표시 합니다. Cl– 채널의 부분 또는 전체 참여 매우 활성 마이그레이션, 확산 및 침해의 높은 비율을 포함 하 여 종양 약의 다양 한 속성에 포함 된다. 이 비추어 클릭, 비 발한 단백질 가족, 암 치료6,7에 대 한 치료 목표의 유망한 클래스 나열 되었습니다. 최근 연구는 계시 했다 CLIC1, CLIC4, CLIC5, 등 클릭 가족의 심장 미토 콘 드리 아를 지역화 반응성 산소 종 (선생님) 레벨 이며 CLIC5에 의해 upregulated Cl 있는 미토 콘 드리 아의 기능 역할을 나타내는 – apoptotic 응답8채널. CLIC4, (일컬어 mtCLIC, P64H1, 및 RS43), 클릭 가족의 한 구성원을 가장 광범위 하 게 암 세포 및 subcellular 위치 등 골, 바인딩과 그물 mitochondrion 인간의 apoptotic 규칙 속성에 대 한 공부 하고있다 keratinocytes7,,910. CLIC4의 식 프로필 종양 괴 사 인자-α (TNF-α), P53, 그리고 외부 자극에 의해 규제 했다. Overexpression 및 CLIC4의 downregulation Bcl-2 가족 구성원의 불균형 caspase 캐스케이드의 활성화 및 시 토 크롬 C11, 의 출시와 함께 미토 콘 드리 아 통로 통해 주로 apoptotic 응답 방 아 쇠 12 , 13. 따라서, MMP 측정 하는 중요 한 탐구 CLIC4 관련 apoptosis 그리고 Rh123 이상적인 형광 표시기로 제공.
현재 연구 HN4 셀에 CLIC4 최저 유도 된 apoptosis를 공부 하는 MMP의 검출에 대 한 자세한 프로토콜을 설명 합니다. Rh123 형광 프로브로는 MMP의 변화를 관찰 하는 데 사용 됩니다. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변동 해결 될 수 있습니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 자세히, 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여. 이 프로토콜도 다른 apoptosis 관련 연구에 적용할 수 있습니다.
잘 Cl− 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암17에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 ?…
The authors have nothing to disclose.
친절 하 게 우리는 세포 배양에 대 한 씨 차오 팡 감사합니다. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81570403, 81371284);의 자연 과학 재단에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 안후이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 1408085MH158); 안후이 의과대학;의 뛰어난 젊은 수 사관 안후이 성의 대학에 우수한 젊은 인재에 대 한 프로그램을 지원합니다.
HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |