共焦荧光显微镜和激光微辐照提供的工具, 诱导 dna 损伤和监测的反应, dna 修复蛋白在选定的 sub-nuclear 地区。这项技术大大提高了我们对损伤检测、信号和招聘的认识。这份手稿演示了这些技术, 检查单和双链断裂修复。
高度协调的 dna 修复通路存在检测、切除和替换受损的 dna 基, 并协调 dna 链断裂的修复。虽然分子生物学技术已经明确了结构, 酶的功能, 和修复蛋白的动力学, 仍然有需要了解如何修复是在细胞核内协调。激光微辐照为诱导 DNA 损伤和监测修复蛋白的招募提供了有力的工具。激光微辐照诱导 DNA 损伤可以发生在波长范围内, 用户可以可靠地诱导单链断裂, 基底病变和双链断裂的剂量范围。在这里, 激光微辐照用于检测由两个共焦激光波长, 355 nm 和 405 nm 诱导的单和双链断裂的修复。此外, 还描述了用于诱导特定损伤混合物的激光剂量的适当表征, 使用户可以性进行激光微辐照数据的采集和分析。
荧光显微镜已经成为一种强有力的技术来可视化细胞结构, 检查蛋白质的定位, 并监测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 相互作用。使用荧光显微镜研究 dna 损伤反应的应用后, 全球 dna 损害剂, 如紫外线 (UV) 光, 电离辐射, 化学氧化或烷剂, 和/或化疗提供了新的洞察dna 修复蛋白在 dna 损伤部位的启动、信号传导和招募1,2。然而, 这些全球性和异步破坏性事件的限制, 如果详细信息有关的招聘秩序, 动力学的联系或离解, 以及关键 DNA 修复蛋白之间的关系寻求。幸运的是, 在过去25年中, 激光扫描共聚焦显微镜的进步、损伤诱导激光波长的更广泛的可用性以及荧光蛋白的改进, 为研究人员提供了改进的工具。dna 修复方面, 通过靶向 dna 损伤诱导。
细胞与激光 microbeams 的辐射, 以研究细胞和亚单位功能是一个行之有效的工具, 在细胞和辐射生物学3。该技术在 dna 修复研究中的应用出现在郭理默和同事使用高度聚焦的紫外线 (257 nm) 激光微系统诱导中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的0.5 µm 斑点的 dna 损伤时,4并建立了诱导这个系统的 DNA photolesions5。虽然在当时对 UV 微方法提供了显著的改进, 但由于它的专门设置和无法生成双链断裂 (DSBs)6, 因此采用这种破坏性系统是有限的。随后对各种紫外线-b (290-320 nm) 和紫外线 a (320-400 nm) 波长的研究表明, 紫外线化、氧化基底病变、单链断裂 (办学) 和 DSBs 可以诱导依赖于激光波长和电源应用4,7,8,9,10 (在3中进行了审阅)。此外, 这些紫外线-b 和紫外线-波长与敏感剂, 如脂, 尿 (BrdU) 和赫斯特染料, 也被发现, 以诱导 DNA 损害的波长, 功率和持续时间的暴露, 虽然需要的权力在这些代理11、12、13、14、15的存在中, 通常会降低诱导损坏。这些进步扩大了微辐照的使用, 尽管仍有技术上的障碍需要解决, 以便更广泛地采用这些方法。
郭理默和同事通过精确聚焦紫外线微, 在细胞内高度局部化的区域应用显著的破坏性能量, 显著地提高了微辐照的领域。随着共焦显微镜和激光显微切割系统的先进, 紧凑的聚焦光更广泛地接近;然而, 耦合 UV 源的范围和处理他们所诱发的色差仍然给大多数用户带来了重大挑战3,6,16。随着 uv 染料在整个二十世纪九十年代的普及, 能够聚焦和捕捉紫外激发荧光的光学变得更加广泛可用16, 并且激光扫描的改进为用户提供了创建高度聚焦紫外线的能力。单元格中的励磁点6,17。然而, 直到2000s 代初, 这种紧密聚焦光束与高强度激光结合的真正影响被认为是, 当大量的报告显示, DNA 链断裂可以诱导和没有剂在UV-一个范围6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25、26, 甚至在较长的可见波长 (如 488 nm27) 上。这些进步使微辐照技术在许多商业系统中得到更广泛的采用。与这些发展同时, 双光子技术也出现了, 允许精确诱导 DNA 损伤;虽然这些进展不会在这里讨论, 但有许多评论文章讨论这些方法9,28,29,30。
随着目前可利用的共焦显微镜能够提供高度聚焦的紫外线光和广泛的可用性荧光蛋白, 使 real-time 跟踪 DNA 修复蛋白, 微辐照技术已演变成检测 DNA 损伤反应和修复通路的强大工具。然而, 用户需要知道, DNA 损伤的产生高度依赖于激光波长和功率应用于 sub-nuclear 地区。使用紫外线-C (〜 260 nm) 波长允许直接 DNA 激发和高选择性的感应紫外线化7,8。紫外线-b 和紫外线-波长产生 DNA 损伤的混合物 (基底病变, 办学, 和 DSBs), 依赖于应用电源和蜂窝背景使用7。靶细胞内源性光敏和抗氧化剂水平能影响这些波长产生的 DNA 损伤混合物。此外, 外源光敏 (BrdU 等) 的使用可能有助于降低诱导 DNA 损伤所需的能量。然而, 这些药物可以自行诱导 DNA 损伤, 它们可能改变细胞周期和染色质结构, 因此它们的使用可能产生不需要被用户考虑的不良影响。因此, 在使用微辐照研究 dna 损伤反应和修复之前, 仔细考虑 dna 修复通路的兴趣, 可供使用的波长和 dna 损伤混合物所产生的需要。
在这里, 激光微辐照是在两个常用波长, 355 nm 和 405 nm, 没有剂, 以证明这些波长引起的 DNA 损伤的混合物, 以及这些损伤混合物对检查修复的影响办学和 DSBs. 用户应该知道, 这些波长不会产生一个单一的链断裂或基底损害物种。为了区分 dna 修复通路, 使用者必须仔细控制细胞核的特定区域的应用功率, 并利用多股断裂标记物和 dna 损伤抗体来表征诱导损伤。如果正确应用和表征, 激光微辐照可以丰富一些物种的 DNA 损伤, 允许用户评估修复的基础病变和办学或 DSBs, 具有一定的特异性。因此, 我们提供了一种允许用户性进行激光微辐照的方法, 表征了应用激光剂量诱导的 DNA 损伤混合物, 并进行了数据分析。
使用这里描述的条件, 任何与 UV a 或 405 nm 激光的共焦显微镜, 无论是由制造商集成的还是由最终用户添加的, 都可能导致细胞细胞核内的 dna 损伤, 并允许将 dna 修复蛋白招募到诱发的 DNA 损伤被监测。但是, 正如在协议和代表性结果中指出的, 波长选择、应用功率和损伤特性都是用户首先必须解决的重要问题, 以便研究特定的 DNA 修复途径。此外, 在实验设计中还有其他的注意事项, 也必须由用户考虑。
为了监测在微辐照后的活细胞中蛋白质的行为, 必须建立荧光标记蛋白。可光谱分离的多种荧光蛋白的可用性提供了创建蛋白质融合的工具, 可用于表征细胞对诱导 DNA 损伤的反应。短暂转染的荧光蛋白的利益, 可以快速筛选的破坏性条件, 突变, 甚至抑制剂, 而稳定的转基因细胞提供更多的表达水平的控制, 并允许其他生物化学进行表征, 验证微辐照效果。光谱不同的荧光蛋白也可以在同一细胞中使用, 以监测同一通路内或不同通路中蛋白质之间的相互作用。荧光蛋白也消除了对每个感兴趣的蛋白质的特定抗体的需要, 并允许在诱导损伤后长时间内对蛋白质行为进行活体监测。
然而, 使用荧光蛋白也有缺点。没有基因的背景缺乏的蛋白质 (s) 的兴趣, 内源性蛋白质将与荧光标签的蛋白质竞争。将荧光标记与蛋白质的 N 或 C 末端结合, 可以改变蛋白质的折叠, 阻碍关键蛋白-蛋白质相互作用, 或阻断易位信号;改变职能和潜在影响招聘动态。在一些报告中, 荧光染色显示了在损伤站点28中内源蛋白的招募和保留时间明显不同, 这些影响已经被证实。使用瞬变转染或稳定克隆也可以改变观察到的反应, 通常是通过蛋白质表达水平的变化。此外, 在单一实验中使用多种荧光蛋白也可能改变招聘的动态, 如果蛋白质水平不平衡好, 或者如果招募更大的荧光标签的蛋白质阻止其他蛋白质的招募.最后, 荧光蛋白可以作为弱敏化剂, 增加活性氧的形成, 并有可能改变 DNA 损伤混合物诱发46,47。尽管有这些缺点, 荧光蛋白在研究 DNA 修复和微辐照方面提供了许多明显的优势, 如果用户能纳入适当的控制, 如这里描述的损伤特性, 他们可以提供新的洞察力到损伤反应和蛋白质-蛋白质相互作用3。
如果不需要活体细胞成像, 可以用免疫荧光法监测诱发损伤的反应。通过固定细胞在特定时间后损伤诱导和染色抗体特异的蛋白质和病变的利益, 静态快照的损伤诱导和招募和保留修复蛋白可以建立。抗体可以用来监测的招募多蛋白的兴趣和/或修饰修改诱导的 DNA 损伤反应。使用免疫荧光消除了对荧光蛋白的需要, 并允许对内源性蛋白质行为进行检查。但是, 这种方法也有其缺点。高度特异的抗体是必要的, 性和阻断程序需要优化, 以允许检测的招聘有足够的信号强度。固定过程不是瞬时的, 这种物理约束限制了这种方法的时间分辨率。绘制损伤诱导部位的图谱, 使细胞在染色后可以重新, 也会出现重大的挑战。在这项工作中使用的共焦显微镜允许基于图像的注册, 如上所述, 因此受损的细胞可以迁移高精度。如果阶段注册或蚀刻 coverglass 不可用, 时间投资涉及的搬迁细胞没有阶段登记, 再加上固有的延迟损伤诱导和图像招募, 可以使免疫荧光对某些用户没有吸引力。然而, 最准确和完整的微辐照实验设计将结合这些类型的方法, 同时使用荧光蛋白, 如所介绍的协议。
在这里, 使用活体细胞成像和免疫荧光技术来证明激光微辐照的效用。荧光染色使我们能够准确地检查 DNA 损伤的混合, 以及由每种激光能量引起的蛋白质的招募, 这使我们能够更好地解释在招募和保留 XRCC1-GFP 的观察到的改变。根据这些结果, 405 nm 激光器的使用应限于检查 BER 和 SSBR 蛋白。此外, 最佳的实验设计将包括在目标之后的功率测量, 对每一个细胞线的完整损伤混合物的描述, 以及在荧光标记蛋白质中观察到的招募和保留的验证荧光.显然, 设备、时间和成本考虑可能使某些用户无法进行这些优化的实验设计。然而, 这些元素的重要性在这里演示, 在开始微辐照实验时, 用户应该牢记这些因素。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢国家环境健康科学研究所的 Dr.. 威尔逊在这项工作中使用的细胞系。
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
NIS Elements software | Nikon | ||
355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
HCl | Fisher | SA49 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |