Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo
Summary
Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.
Abstract
Chemotaxis is migratie langs een specifieke chemische kleurovergang1. Chemokines zijn Chemotactische cytokines die bevordering van cellulaire mensenhandel met anatomische en temporele specificiteit2. Chemotaxis is een kritische functie van lymfocyten en andere immune cellen die kwantitatief kunnen worden beoordeeld in vitro. Dit manuscript worden methoden beschreven die de evaluatie van de chemotaxis, zowel in vitro en in vivo, voor diverse celtypen, met inbegrip van de cellijnen en inheemse cellen. De in vitro, plaat gebaseerde indeling toelaat de vergelijking van verschillende voorwaarden gelijktijdig in real-time, en kan worden afgerond binnen 1-4 h. In vitro assay voorwaarden kunnen worden gemanipuleerd om het introduceren van agonisten en antagonisten, als goed als onderscheiden chemotaxis van chemokinesis, die willekeurige beweging is. Voor in vivo mensenhandel evaluaties, kunnen immuuncellen worden aangeduid met meerdere fluorescente kleurstoffen en gebruikt voor de overdracht van de adoptie. De differentiële etikettering van cellen zorgt voor gemengde cel populaties worden ingevoerd in hetzelfde dier, daardoor dalende afwijking en de vermindering van het aantal dieren dat nodig is voor een adequaat aangedreven experiment. Migratie naar lymfoïde weefsel optreedt in zo weinig als 1 h en meerdere compartimenten van het weefsel kunnen worden bemonsterd. Stroom cytometry weefsel oogst na zorgt voor een snelle en kwantitatieve analyse van de migratiepatronen van meerdere celtypen.
Introduction
Robuuste immuniteit vereist de complexe temporele en ruimtelijke coördinatie van een groot aantal celtypes om te reageren op verwonding, besmetting en genereren van self-tolerance. Verscheidene dozijn chemokine receptoren en hun overeenkomstige liganden zijn geconstateerd; gekarakteriseerd bieden moleculaire mechanismen door welke specifieke cellen in een specifieke weefsel kunnen worden gericht op een bepaald tijdstip. Studeren chemotaxis en migratie is dus een onmisbaar onderdeel van het onderzoek van de immunologie. Inderdaad, de beschreven in vitro -assay werd onlangs gebruikt als een instrument voor screening ter identificatie van een Chemotactische cofactor die chemotaxis van T-cellen naar C-C chemokines 19 en 213 versnelt. Het doel van de hier beschreven methoden zijn om vergunning van kwantitatieve analyses van immuun cel chemotaxis in vitro en in vivo.
De bepaling van de kamer Boyden (cel migratie en invasie) is een snelle, goedkope en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de cel migratie4,5. In de standaard assay, het Hogerhuis is bezaaid met cellen, en is gescheiden door een poreuze invoegen uit een tweede kamer, waarin de cellen migreren. Op het gewenste tijdstip, kunnen cellen die aan de onderkant van het donormateriaal hebt gemigreerd worden vastgesteld en gekleurd voor de kwantificatie van de lichte microscopie. Echter, dergelijke metingen beperken het verzamelen van gegevens naar een enkel eindpunt, die zich verzet tegen dynamische gegevensverzameling en uitgebreide optimalisatie om het optimale tijdstip voor analyse kunnen vereisen. Hier worden verschillende aanpassingen beschreven waarmee multiplexed, real-time en kwantitatieve metingen van chemotaxis in vitro.
Voor in vivo studies, een functionele eindpunt wordt gebruikt, namelijk de specifieke accumulatie van cellen in een bepaald weefsel compartiment. Vooraf gelabelde donor cellen worden in ontvangende dieren door middel van adoptie overdracht binnengebracht. Deze cellen van de donor kunnen vervolgens worden geïdentificeerd door stroom cytometry na de oogst van de ontvangende weefsel. Ook gepresenteerd is een co labeling strategie die het mogelijk voor de bepaling maakt van de handel in verschillende soorten cellen binnen een enkele begunstigde dier. Deze methode elimineert de dieren variatie van cel injectie, en rekeningen voor fysiologische spreiding over de dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kwantificering van immuun cel migratie kan worden bereikt met behulp van eenvoudige en snelle testen zowel in vitro als in vivo. We tonen de chemotaxis in vitro van menselijke monocyten in reactie op een MCP-1 verloop en vergroting door serum. In vivo, donor lymfkliertest splenocytes differentieel waren gelabeld en na de overdracht van het adoptie, werden teruggevonden van geadresseerden dieren.
Het gebruik van een afleesapparaat heeft het voordeel van de ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Bernard L. Schwartz programma voor arts-wetenschappers aan de Rockefeller University, het Ontwikkelingsfonds Robertson therapeutische aan de Rockefeller-universiteit en de Sackler Center voor biogeneeskunde en Nutrition Research op de Rockefeller University.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
