Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación parálisis y opticospinal por la transferencia de la Acuaporina-4 (AQP4)-células de T específicas de AQP4 ratones– / – en ratones WT. Además, se demuestra cómo utilizar la tomografía de coherencia óptica serial para controlar la disfunción del sistema visual.
Si bien se reconoce que Acuaporina-4 (AQP4)-anticuerpos y células T específicas participan en la patogenia de la Neuromielitis óptica (NMO), una enfermedad desmielinizante autoinmune humana del sistema nervioso central (SNC), creación de un modelo objetivo de AQP4 con ambos manifestaciones clínicas e histologic de la autoinmunidad de la CNS ha demostrado ser un reto. Inmunización de ratones de tipo salvaje (WT) con péptidos de AQP4 produce proliferación de células T, aunque esas células de T no podían transferir la enfermedad a ratones receptores ingenuos. Recientemente, novela dos epítopos de células T de AQP4, péptido (p) 135-153 p201-220, se identificaron y al estudiar las respuestas inmunitarias de AQP4 en ratones deficientes de AQP4 (AQP4– / –), sugiriendo la reactividad de células T a estos epitopos es normalmente controlada por Timo selección negativa. AQP4– / – Th17 polarizado células T cebadas p135-153 o p201-220 inducido parálisis en receptoras ratones WT, que se asoció con predominante leptomeningeal inflamación de la médula espinal y nervios ópticos. Inflamación circundante los nervios ópticos y la participación de las capas retinianas internas (IRL) se manifiestan por cambios en la tomografía de coherencia óptica serial (OCT). Aquí, nos ilustran los enfoques utilizados para crear este nuevo modelo en vivo de la autoinmunidad de la CNS dirigido AQP4 (ATCA), que ahora puede ser empleada para estudiar mecanismos que permitan el desarrollo de patógenas células T específicas de AQP4 y cómo puede cooperar con B células en la patogénesis de la NMO.
Neuromielitis óptica (NMO) es una enfermedad desmielinizante inflamatoria autoinmune de sistema nervioso central (SNC) que causa episodios recurrentes de parálisis y pérdida de la visión lleva a discapacidad neurológica permanente1. NMO es considerado sobre todo al ser una enfermedad autoinmune humoral2 se asocia con anticuerpos (Igs) contra Acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua que se expresa abundantemente en los astrocitos3,4. Sin embargo, la inflamación del CNS es un prerrequisito para la entrada del CNS de AQP4 Ig5,6. Por lo tanto, no ha sido posible establecer un modelo de NMO por la transferencia de anti-AQP4 Igs solamente. Las conclusiones que (1) patógenos Igs específicas de AQP4 en pacientes NMO son IgG11,2, un Ig de dependiente de la célula de T en NMO lesiones8,9 (3) NMO se identifican células de T de subclase7 (2) se asocia con ciertos genes de MHC II (por ejemplo, HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10y proinflamatorias (4) Dr. AQP4 reactiva-Th17 restringida que las células se expanden en la NMO pacientes11,12 todos indican que las células T específicas de AQP4 tienen un papel clave en la patogenia de la NMO. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos animales para determinar cómo las células T específicas de AQP4 pueden contribuir a la patogenesia NMO.
Hace varios años, se identificaron múltiples epitopos de células T de AQP4 en wild-type (WT) ratones13,14 y ratas15. Mientras que se observó que las células T reactivas con AQP4 podrían inducir inflamación opticospinal en ingenuo receptor ratas15,16, no se observaron signos clínicos significativos de la enfermedad del CNS. Del mismo modo, dirigir la inmunización de los ratones WT con los péptidos que contienen AQP4 T célula epitopos14,17, o transferencia de células proinflamatorias T dirigidas a los determinantes17, no provocó signos clínicos o histologic evidencia de autoinmunidad de la CNS.
Recientemente, se observó que inmunización de ratones C57BL/6 AQP4-deficientes (AQP4– / –) con AQP4 péptido (p) 135-153 o p201-220, dos determinantes predijo a MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad18, sacó fuerte CD4 + De las respuestas de células T17. Por el contrario, estos dos péptidos produce solamente modestas respuestas proliferativas en ratones WT. Además, el repertorio de T cell receptor (TCR) utilizado para el reconocimiento de estos determinantes por las células T de ratones– / – AQP4 era único. Colectivamente, estos resultados indican que la célula de T reconocimiento de AQP4 es regulada por tímica selección negativa. AQP4 p135-153-p201-220-específicos o células Th17 de AQP4– / – ratones donantes inducida por parálisis en casi el 100% de ratones de peso receptoras ingenuo; Esto se asoció con opticospinal infiltrados de células T, linfocitos B y monocitos. Serie opticospinal tomografía de la coherencia (OCT) demostró la implicación del sistema visual dinámico. Ratones con autoinmunidad mediada por células T dirigida AQP4 CNS (ATCA) se recuperaron de la parálisis y lesión del sistema visual. En contraste con EAE inducida por myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG) p35-55-linfocitos T específicos, que condujo a la enfermedad clínica persistente, ATCA inducida por las células T sólo no se asoció con pérdida axonal o la reducción en las células ganglionares de la retina (RGCs). Nuestros resultados han demostrado claramente que hay determinantes patógenos múltiples de la célula T de AQP4. Este nuevo modelo de ATCA es útil para el estudio de mecanismos que controlan el desarrollo de patógenas específicos de AQP4 las células T, aprendiendo cómo las células inducen inflamación del CNS y cómo puede cooperar con las células B específicas de AQP4 y anticuerpos para promover la patogenesia de la NMO .
En el presente informe, se describen los protocolos utilizados para inducir y evaluar inducida por células T ATCA. Comenzamos con las técnicas utilizadas para que inmunización, cultivo de células de T y polarización Th17 para generar patógenas células T específicos de AQP4, análisis de citometría de flujo para confirmar la polarización y transferencia adoptiva de las células T. A continuación describimos los métodos utilizados para evaluar enfermedad clínica e histologic y el uso de OCT serial para controlar lesiones del sistema visual en los ratones receptores.
AQP4 fue identificado como el objetivo principal de IgG de la NMO en 20053. Entonces, se reconoció que sería importante establecer un modelo animal de AQP4-dirigido de la autoinmunidad de la CNS. Tal modelo podría ser útil para investigar cómo las células T específicas de AQP4 y B participan en el desarrollo de la autoinmunidad de la CNS y prueba terapéutica de candidato para NMO. Aunque el reconocimiento específico de AQP4 T epítopos de tipo salvaje ratones primero fue divulgado en 201013, las células T en respuesta a los epitopos no causó enfermedad clínico o histológico14,17. La incapacidad para generar un modelo de autoinmunidad CNS basado en la reactividad inmune a AQP4 seguía siendo un enigma hasta 2015 cuando Jones, et al. 25 descubrió que el donante AQP4 p135-153-preparado las células T de ratones– / – AQP4 eran capaces de provocar signos clínicos e histologic de la autoinmunidad de la CNS en los ratones WT. De interés, AQP4 p135-153 se predice para MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad17. Solamente un otro AQP4 secuencia de aminoácidos, 201-220, se prevé enlazar-Ab con alta afinidad similar. De hecho, observamos AQP4 p135-153 y p201-220 ambos provocan proliferación sólida de AQP4– / –, pero no peso, ratones. Aquí, hemos mostrado cómo se puede aislar y ampliar encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 y p201-220-reactiva las células de T de los ratones– / – AQP4. Cuando transfieren a ratones receptores WT, las células Th17 AQP4 reactiva donante inducida por parálisis, que fue acompañada por la célula mononuclear infiltra en la médula espinal y del nervio óptico. Lesión del sistema visual aferente es bien conocido en pacientes con AQP4 seropositivos NMOSD26. Aquí, observamos que la inflamación del nervio óptico inducida por las células Th17 MOG-reactiva y AQP4 reactivo era distinta. Mientras que las células Th17 específicas AQP4 inducen perineuritis óptica, las células Th17 MOG-específicos inducidos por neuritis óptica severa. También hemos descrito las técnicas utilizadas para controlar la inflamación del nervio óptico inducida por células específicas de AQP4 y T MOG-específicos por OCT serial. Otros investigadores ahora deben ser capaces de aplicar los protocolos descritos aquí para avanzar en sus estudios se centró en los mecanismos patogénicos de ATCA.
Fácilmente uno puede evitar tres escollos potenciales en nuestro protocolo. Primera transferencia adoptiva de ATCA requiere uso AQP4 específicos de células de T de los ratones de AQP4– / – donante. En concreto, las células donantes WT AQP4 p135-153-específico T no causó ATCA en receptoras ratones WT. En segundo lugar, es importante realizar una “prueba de agua” con una gota de la emulsión de péptido/CFA antes de inmunización de AQP4– / – ratones (protocolo paso 1.5). La emulsión no debe dispersarse en agua cuando es conveniente para la inyección s.c.. Si la emulsión dispersa, uno debe mezclar la emulsión una vez más, descansar otra vez y repita la prueba de agua. Por último, las células de T del antígeno específico activado donantes CNS inducen autoinmunidad CNS más eficientemente que la reclinación de las células T. Uno debe inspeccionar visualmente las culturas bajo el microscopio de luz antes de la cosecha de las células de T del donante para la transferencia adoptiva. Rápidamente dividiendo las células puede formar racimos, que son fácilmente identificables. También, cuando las culturas contienen muchas células T activadas, los medios de comunicación pueden transición de color rosado naranja o amarillo, debido a la reducción en el pH. También se puede evaluar activación de las células de ganglio AQP4 preparado T donantes de proliferación por la incorporación de 3H-timidina, tal como se describe en el protocolo de paso 3.
El descubrimiento que los epitopos de células T AQP4 patógenos dos son (1) predice para MHC II se unen con alta afinidad y (2) provocar potentes respuestas proliferativas en AQP4– / –, pero no peso, ratones sugieren que las células T dirigidas a los determinantes son normalmente controlado por selección negativa tímica17. El repertorio TCR para reconocimiento de AQP4 p135-153 y p201-220 en ratones– / – AQP4 es únicas (Figura 2), que también es consistente con la canceladura clónica mediada por las células epiteliales medulares tímicas. Otros mecanismos de tolerogénicas normalmente pueden limitar inmunorespuestas a AQP4. Después de nuestro informe inicial17, otro grupo también demostró que la AQP4 p201-220 contiene un encephalitogenic determinante de la célula de T27. Cuando ratones α/β (TCRα– / –) deficiencia de la célula de T fueron reconstituidos con AQP4– / – CD4+ T las células fue posible provocar una respuesta de células T encephalitogenic AQP4 específicos, pero no una AQP4 específica respuesta humoral, lo que implica que en Los ratones WT respuestas de células B de AQP4 específicas, similares a respuestas de células T específicas de AQP4, son objeto de selección negativa. De hecho, la pérdida de axones de la médula espinal y RGCs, que no se observó en los ratones WT con ATCA inducida por las células T específicas de AQP4 solo, puede requerir participación de anticuerpos patógenos específicos de AQP4. Está claro que modelos murinos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 continuará evolucionando conforme aprendemos más sobre los mecanismos de tolerogénicas normalmente controlan AQP4 específicos de la célula T y célula de B de la inmunidad.
Otros modelos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 también están siendo desarrollados6,16,28,29,30. Cada uno puede ofrecer ventajas para el estudio de determinados aspectos que son relevantes para la patogenesia NMO. Se han identificado linfocitos T específicos de AQP4 en WT ratas6,16,29. Esas células T específicas de AQP4 causaron cambios histologic de la autoinmunidad de la CNS, pero similar a las observaciones en los ratones, las de células T específicas de AQP4 rata WT no causan señales significativas de enfermedad clínica. Por lo tanto, los mecanismos de tolerancia restringiendo la célula de T y células B específicas de AQP4 las respuestas inmunitarias en ratones WT funcionan también en ratas. A pesar de todo, uno no debe subestimar el poder en el uso de modelos de ratón para el estudio de mecanismos implicados en la patogenia de la enfermedad. La riqueza de knock-out, transgénico y ratones reportero puede ser ventajosa. También debe reconocerse que varios descubrimientos fundamentales en la autoinmunidad se hicieron usando modelos de ratón EAE. Por ejemplo, demostración que T cell clones específicos para un antígeno de uno mismo puede mediar enfermedad autoinmune31,32, identificación de la función de coestimulación de la célula de T en autoinmunidad33 y el descubrimiento de la Desarrollo vía de diferenciación Th1734 primero fueron descritos usando modelos de ratón EAE. Usando el modelo del ratón del ATCA que hemos desarrollado, uno ahora tiene los medios para estudiar el desarrollo y la regulación de patógenos específicos de AQP4 inmunorespuestas en vivo, que debe proporcionar penetraciones importantes relacionadas con la patogénesis de la NMO.
The authors have nothing to disclose.
Se prestó apoyo a S.S.Z. por el Instituto Nacional de salud (AI073737 to1 y to1 NS092835-01), sociedad nacional de esclerosis múltiple (4768 RG y RG 5179 5180 RG), Fundación de Maisin y Jackson Guthy Charitable Foundation.
M. tuberculosis H37Ra | BD Difco | 231141 | Dessicated, killed M. tuberculosis |
Incomplete Freund's Adjuvant | BD Difco | 263910 | |
AQP4 peptide p135-153 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN |
AQP4 peptide p201-220 | Genemed | Custom Synthesis | Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP |
MOG peptide p35-55 | Genemed / Auspep | Custom Synthesis | Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
3-way Stopcock | Kimble | 420163-4503 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071 | |
Recombinant Mouse IL-23 | R&D Systems (BioTechne) | 1887-ML | |
Recombinant Mouse IL-6 | R&D Systems (BioTechne) | 406-ML | |
Recombinant Mouse IL-12 | R&D Systems (BioTechne) | 419-ML | |
Thymidine [Methyl-3H] | PerkinElmer | NET027 | |
Glass Fiber Filtermats | PerkinElmer | 1450-421 | |
Anti-mouse antibodies | eBioscience (Affymetrix) | [various] | |
Anti-mouse TCR Vβ Screening Panel | BD Biosciences | 557004 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain | ThermoFisher Scientific | [various] | |
Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug | BD Biosciences | 555028 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Iomomycin (calcium salt) | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Pertussis Toxin from B. pertussis | List Biological Laboratories | 181 | |
10% Formalin | VWR | 89370-094 | |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | |
Foam Biopsy Pads, Rectangular | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Isothesia (isoflurane, USP) | Henry Schein Animal Health | 050033 | NDC : 11695-0500-2 |
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Akorn | NDC: 17478-102-12 | |
Spectralis Diagnostic Imaging Platform | Heidelberg Engineering |