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Cancer Research

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

Published: October 05, 2017
doi:
10.3791/56159
, , , , , , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute,University Health Network

Summary

Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.

Abstract

Quimioterapia de combinação é frequentemente usada na clínica para tratamento de câncer; no entanto, os efeitos adversos associados ao tecido normal podem limitar seu benefício terapêutico. Combinação de drogas baseados em nanopartículas foi mostrada para atenuar os problemas encontrados pela terapia de combinação livre de drogas. Nossos estudos anteriores têm demonstrado que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra ambos murino e células de câncer de mama humano em vitro. Nanopartículas de híbrido de polímero carregado co-lipídico DOX e MMC (DMPLN) através de várias bombas de transportador de efluxo que conferem multirresistência e demonstrada eficácia reforçada em modelos de tumor de mama. Em comparação com formas de solução convencional, tal eficácia superior de DMPLN foi atribuída à farmacocinética sincronizada de DOX e MMC e biodisponibilidade de aumento intracelular de drogas dentro de células de tumor habilitado pelo nanocarreador PLN.

Para avaliar a farmacocinética e bio-distribuição de co administrado DOX e MMC em solução livre e formas de nanopartículas, um método de análise de múltiplas drogas simples e eficiente usando reverso-fase de alto desempenho foi de cromatografia líquida (HPLC) desenvolvido. Em contraste com os métodos anteriormente relatados que analisaram DOX ou MMC individualmente no plasma, esse novo método HPLC é capaz de dosar simultaneamente DOX, MMC e um metabolito principal de DOX cardio-tóxico, doxorubicinol (DOXol), em diferentes matrizes biológicas ( por exemplo, sangue total, tumor de mama e coração). Uma dupla sonda fluorescente e ultravioleta de absorvente 4-methylumbelliferone (4-MU) foi usado como um padrão interno (I.S.) para a deteção de uma etapa de análise de drogas múltiplas com comprimentos de onda diferentes da deteção. Este método foi aplicado com sucesso para determinar as concentrações de DOX e MMC entregado por abordagens tanto nanopartículas e solução no sangue e vários tecidos em modelo murino de tumor de mama um ortotópico. O método analítico apresentado é uma ferramenta útil para a análise pré-clínico de entrega baseados em nanopartículas de combinações de drogas.

Introduction

A quimioterapia é uma modalidade de tratamento primário para muitos tipos de câncer ainda é frequentemente associado com efeitos adversos graves e eficácia limitada devido a resistência às drogas e outros fatores1,2,3. Regimes de combinação de drogas para melhorar o resultado da quimioterapia, foram aplicados na clínica com base em considerações como toxicidades não-sobreposição, diferentes mecanismos de ação de drogas e drogas não-cruz resistência4,5 , 6. em ensaios clínicos, uma melhor taxa de resposta do tumor foi muitas vezes observada usando simultaneamente administrados combinações de drogas, em comparação com um regime de drogas sequencial entrega7,8. No entanto, devido à sub-ótimo bio-distribuição de formulários de droga livre, injeção simultânea de múltiplas drogas pode causar toxicidade proeminentes tecido normal que supera o efeito terapêutico9,10,11. Entrega de drogas baseadas em nanocarreador foi mostrada para alterar a farmacocinética e bio-distribuição de medicamentos encapsulados, aumentando a acumulação de tumor-alvo12,13,14. Como comentado em nossos artigos recentes, nanopartículas co carregadas com combinações sinérgicas de drogas têm demonstrado a capacidade de atenuar os problemas enfrentados por combinações de drogas livre, devido a sua controlada entrega co temporal e espacial de várias drogas ao tecido do tumor, permitir efeitos sinérgicos droga contra o câncer células4,15,16. Como resultado, superior eficácia terapêutica e baixa toxicidade foram demonstradas em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos4,17,18.

Nossos anterior em vitro estudos encontraram que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra várias linhas de células de câncer de mama e, além disso, co carregando DOX e MMC dentro nanopartículas de lipídios-polímero híbrido (DMPLN) superaram vários resistente a múltiplas drogas associado efluxo bombas (por exemplo, P-glicoproteína e proteína resistente ao cancro da mama)19,20,21. In vivo, DMPLN habilitado entrega co espaço-temporal de DOX e MMC para localizações tumorais e maior biodisponibilidade de drogas dentro de células de câncer, conforme indicado pela moderação da formação do metabólito DOX doxorubicinol (DOXol)22. Como resultado, o DMPLN reforçada a apoptose de células do tumor, inibição de crescimento do tumor e sobrevivência de acolhimento prolongado em comparação a livre combinação de DOX e MMC ou um lipossomal DOX formulação22,23,24, 25.

Analisando a quantidade real de drogas fornecido em parceria pela nanocarreador é fundamental para a concepção de formulações de nanopartículas eficaz. Muitos métodos foram desenvolvidos para analisar o nível plasmático de único doses DOX ou MMC usando alta cromatografia líquida (HPLC) sozinha ou em combinação com a espectrometria de massa (MS)26,,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. no entanto, estes métodos são muitas vezes demorado e impraticável para a terapia de combinação como um grande número de amostras biológicas precisa ser preparados separadamente para análise de múltiplas drogas (às vezes incluindo metabolitos de drogas). Além da ligação às proteínas plasmáticas forte de DOX e MMC, glóbulos vermelhos também têm uma grande capacidade de vincular e concentrar muitas drogas anticâncer35,36. Assim, a análise de plasma para DOX ou MMC pode ofuscar concentrações de droga de sangue real. O presente trabalho (Figura 1) descreve uma maneira simples e robusto método de análise de drogas múltiplas usando fase reversa HPLC para extrair simultaneamente e dosar DOX, MMC e o DOX metabólito doxorubicinol (DOXol) de sangue total e diversos tecidos ( por exemplo, tumores). Foi aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de DOX e MMC, bem como a formação de DOXol após a entrega da droga através de soluções livres ou formas de nanopartículas (i.e., DMPLN e DOX lipossomal) em um orthotopically implantou o modelo de rato da mama-tumor murino após a intravenosa (i.v.) injeção22.

Protocol

todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal conta Comissão de University Health Network no Ontario Cancer Institute e conduzidos de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal. 1. preparação da amostra biológica coletar o sangue total, os principais órgãos e tumor de mama nos pontos de tempo predeterminados após administração intravenosa (IV) de contendo fármaco formulações (por exemplo, DMPLN, DOX lipossom…

Representative Results

Duas drogas anticâncer, DOX e MMC, bem como o metabólito DOX, DOXol, foram detectado simultaneamente sem qualquer interferência biológica sob a condição HPLC aplicada mesma gradiente usando 4-MU como o I.S. para os detectores de UV e fluorescência. DOX, MMC, DOXol e 4-MU foram bem separados uns dos outros com tempos de retenção de 5,7 min para MMC, 10,4 min para DOXol, 10,9 min para 4-MU e 11,1 min para DOX (Figura 2). Cada fármaco no sangue e vári…

Discussion

Em comparação com outros métodos cromatográficos que permitem a detecção de uma espécie única droga de cada vez, o presente protocolo HPLC é capaz de dosar simultaneamente três compostos de drogas (DOX, MMC e DOXol) na mesma matriz biológica sem a necessidade de mudar a fase móvel. Esse método de preparação e análise tem sido aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de dois sistemas de entrega de drogas baseados em nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem com gratidão a concessão de equipamentos da ciência Natural e pesquisa de engenharia (NSERC) Conselho de Canadá para HPLC, a subvenção de funcionamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR) e pesquisa de câncer de mama canadense (CBCR) Aliança para X.Y. Wu e a bolsa da Universidade de Toronto para R.X. Zhang e T. Zhang.

Materials

Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).
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