Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats
Summary
Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.
Abstract
Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie television in vitro pour évaluer la fonction vasculaire dans les artères isolées de résistance cérébrale (et d’autres bateaux) et décrit les techniques permettant d’évaluer la perfusion tissulaire en utilisant le Laser Doppler débitmétrie (LDF ) et densité microvaisseaux utilisant fluorescent étiqueté lectine de Griffonia simplicifolia (GS1). Les méthodes actuelles pour l’étude isolement des artères de résistance au transmurale pressions rencontrées en vivo et en l’absence de cellules parenchymateuses influences fournissent un lien essentiel entre les études in vivo et les renseignements obtenus à partir de moléculaire approches réductionnistes qui donnent un aperçu limité de réponses intégratives au niveau animaux. LDF et techniques pour identifier sélectivement les artérioles et capillaires avec fluorescent marqué GS1 lectine fournissent des solutions pratiques pour permettre aux enquêteurs d’étendre les connaissances tirées de l’étude des artères de résistance isolée. Cet article décrit l’application de ces techniques d’acquérir des connaissances fondamentales de la physiologie vasculaire et de la pathologie chez le rat comme modèle expérimental général et dans une variété de spécialisées génie les souches de rats « designer » qui peuvent fournir important aperçu de l’influence des gènes spécifiques sur les phénotypes vasculaires importants. Utilisant ces approches expérimentales précieux dans les souches de rats mis au point par des stratégies de reproduction sélective et nouvelles technologies de production de modèles de knock-out du gène chez le rat, élargira la rigueur des scientifiques locaux mis au point dans les modèles de souris knock-out et étendre cette connaissance à un modèle animal plus pertinent, avec un contexte physiologique bien compris et les qualités d’études physiologiques en raison de sa plus grande taille.
Introduction
Les premières études de la fonction vasculaire dans les artères de conduit artères utilisées et dans de nombreux cas, l’aorte. Mise sur pied dans les grosses artères a été généralement étudiée en attachant un segment de l’anneau de l’artère d’un capteur de force dans un bain de tissu ; dans le cas de l’aorte, par une coupe hélicoïdale bandes du navire afin que les fibres musculaires lisses étaient orientés dans la direction longitudinale entre le point d’attache et le capteur de force, de fournir la meilleure estimation de la force générée par la contraction de le muscle lisse le long de son axe longitudinal. La technique standard pour la découpe de bandes hélicoïdales d’aortes consistait à placer une baguette de verre dans la lumière du vaisseau, faire une incision dans la paroi des vaisseaux sur l’angle désiré et accrochez-vous à la fin du bord de la paroi des vaisseaux exposé comme la coupe a été étendue afin de produire l’intégralité d’une bande hélicoïdale du navire. À ce moment-là, la face endothéliale du navire était généralement effacée afin d’éliminer les débris avant de fixer la bande du navire pour le capteur de force et submergeant la préparation dans une oxygéné et préparation tissulaire à température contrôlée. Finalement, qu’approche conduit à une des découvertes plus célèbres et importants dans l’histoire de la physiologie par Robert Furchgott et Zawadski1, à savoir le rôle de l’endothélium dérivé facteur relaxant (EDRF), par la suite identifié comme l’oxyde nitrique, dans régulation de la fonction vasculaire. L’événement crucial ayant mené à cette découverte est une situation dans laquelle les enquêteurs maintient un endothélium intact en évitant le contact du côté de l’artère avec surfaces étrangères endothélial et remarqué que les bandes d’aortes ne montrent pas les attendus contraction à l’acétylcholine (ACh), mais plutôt détendu en réponse à l’ACh. Basé sur cette observation, les enquêteurs ont mis au point une préparation « sandwich » dans laquelle ils ont attachaient un segment aortique avec un endothélium intact (mais il est incapable de générer une force contractile) sur une bandelette hélicoïdale standard de l’aorte et converti induite par l’ACh contraction dans une détente.
Deux avancées majeures dans ce domaine qui sont largement utilisées aujourd’hui sont le développement de préparations pour mesurer la force contractile active dans la résistance petites artères2,3 (comme dans le mésentère intestinal3 ) et canulé résistance artère préparations4,5,6. Dans un des premiers rapports, Mulvany et Halpern3 décrit l’utilisation de la préparation de myographe fil pour étudier la force contractile active dans les artères de résistance isolée du mésentère intestinal des rats spontanément hypertendus (SHR) et contrôles WKY normotendus. À la suite de l’élaboration du système fil myographe, préparations d’artères de résistance canulés ont été développées afin de permettre des études des vaisseaux plus près en vivo conditions4,5,6. Alors que les deux approches fournissent des résultats précieux, la préparation de l’artère canulées a l’avantage supplémentaire de plus effectivement préserver tonus actif intrinsèque dans les artères ; et en permettant aux chercheurs de l’étude actives myogènes réactions aux changements transmurale pression et navire réponses aux variations de débit et endothéliale contrainte de cisaillement (voir examen de Halpern et Kelley6).
Des principaux objectifs du présent document sont de décrire comment employer la technique séculaire des artères de résistance isolés, canulées microscopie vidéo afin d’obtenir des informations précises quant aux mécanismes qui régulent la tonalité active dans ces crucial navires, indépendantes des influences de cellules neurales, humorale ou parenchymateux. Cette information de base, utilisant un modèle de rat standard et des exemples de nos études de nouveau génétiquement machiné des souches de rats, fournira au lecteur une idée des types de la perspicacité au sujet de la fonction vasculaire qui peut être obtenu avec la télévision méthodes de microscopie, et qui peuvent être utilisés dans les études impliquant n’importe quel contrôle et expérimentales ou les groupes de choix de l’enquêteur, y compris les puissants nouveaux modèles expérimentaux rat produit par consanguinité sélective et nouvellement développé génétique techniques d’ingénierie.
Grâce à la précision des méthodes de microscopie de télévision, mesure des changements de diamètre dans des préparations d’artères canulées peut fournir des informations très utiles concernant les mécanismes de l’endothélium-dépendante et indépendante de l’endothélium de vasculaire relaxation, ainsi que des modifications importantes (et parfois inattendues) dans les mécanismes de contrôle vasculaire survenant avec l’hypertension, régime hypersodé et autres interventions expérimentales. En outre, mesure des relations pression-diamètre en isolé et canulé artères de résistance qui sont détendus au maximum par un traitement avec Ca2 +-gratuit solution ou un médicament vasodilatateur pharmacologique, permet à l’enquêteur d’évaluer changements structurels dans les artères en raison de remodelage vasculaire et pour calculer la contrainte passive relations7 qui peut donner un aperçu important de changements des propriétés mécaniques passives des artères qui peuvent affecter la fonction artérielle autonome de (ou en plus) changements dans les mécanismes de contrôle actif. Il est également important de noter qu’information tirée des études des artères de résistance isolée peut être complétée par les informations obtenues utilisant LDF, une méthode pratique pour l’évaluation de la perfusion tissulaire à l’animal tout niveau8,9 ,10, et de l’information obtenue grâce à l’évaluation des microvaisseaux de densité à l’aide de fluorescent étiqueté lectine de GS1, qui se lie spécifiquement aux portions de glycoprotéine dans les membranes basales des petites artérioles et capillaires11 , 12. la dernière méthode fournit une estimation très précise des microvaisseaux densité qui ne relève pas des classiques difficultés rencontrées dans l’estimation de densité des microvaisseaux en comptant les navires en vivo, par exemple manquant non perfusés navires où le débit sanguin est arrêté en raison de la fermeture active des artérioles. Utilisés ensemble, ces approches peuvent fournir un aperçu important pour mettre en corrélation les altérations fonctionnelles dans les artères isolées de résistance aux changements de perfusion tissulaire au niveau microcirculatoire ; et quelques exemples de l’utilisation de ces approches précieux conjointement avec artère canulées techniques seront également fournis dans le présent manuscrit.
Le présent document met l’accent sur l’utilisation des techniques de microscopie vidéo pour évaluer des changements vasculaires dans les artères des rats Sprague-Dawley non consanguins. Cependant, il est important de noter que ces techniques se sont avérés pour être très utiles dans l’élucidation des altérations phénotypiques de souches hautement spécialisés rat génétiquement créés par reproduction sélective ou de gène en utilisant des techniques d’édition. Dans ce manuscrit, nous fournir des exemples des techniques de microscopie vidéo comment ont fourni des renseignements importants au sujet de la fonction vasculaire dans un certain nombre de rat précieux modèles, dont la souche de rat-an consanguins rat Dahl sensibles au sel (SS) qui est le plus largement modèle expérimental permettant d’étudier les mécanismes du sel hypertenson sensible18,19,20,21,22,23; et les rats de tendance créés par reproduction sélective des rats SS avec la souche de rat Brown Norway (BN) sel-insensible. Dans les panneaux de rat tendance, chaque chromosome chez le rat Brown Norway a été introduits individuellement dans le bagage génétique Dahl SS24,25,26 . Utilisation de panneaux de rat tendance a fourni des indices précieux sur les chromosomes spécifiques qui contribuent au sel sensibilité de la pression artérielle et d’autres phénotypes, y compris la vasoréactivité24,25,26 ,27,28.
Stratégies de reproduction sélective utilisant SS rats et rats de toutes porteuses de chromosomes individuels de BN ont également permis la génération de souches congéniques rétrécie avec petits segments d’individuels Brown Norvège chromosomes introduits dans la SS Dahl génétique fond22,29. Ceux-ci peuvent fournir des gènes spécifiques extrêmement précieux d’entrée sur ou réduire leur régions des chromosomes qui peuvent affecter les variables physiologiques essentiels, tels que l’hypertension, lésions rénales et réactivité vasculaire22,29. Un autre plus puissant à la boîte à outils génétique du rat est le développement de modèles de rats gène knockout utilisant avancée gène édition techniques y compris ZFNs, transcriptionnelles activator-like-effecteur nucléases (TAPS) et plus récemment CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. L’avènement de ces techniques puissantes qui permettent des gènes d’être assommé chez le rat est une évolution extrêmement importante parce que le gène knockout études à ce jour ont utilisé (et continuent à utiliser) souris presque exclusivement. Une autre composante expérimentale dans le présent document démontre la valeur des techniques de l’artère canulés et microscopie vidéo afin d’évaluer les mécanismes de contrôle physiologique chez les rats knockout manque la transcription de protection antioxydante et cellule maître facteur, facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) – like – 2 (NRF2)30,31, qui ont été développés à l’aide de la technologie TALEN dans le bagage génétique de Sprague-Dawley17. Dans ces expériences, techniques de microscopie vidéo in vitro ont été utilisés pour assurer la vérification fonctionnelle de la perte du gène NRF2 et tester une approche thérapeutique potentiellement précieuse basée sur directe upregulation de NRF2-mediated antioxidant défenses. NRF-2 est de grande importance thérapeutique dans la lutte contre le stress oxydant vasculaire chez les humains, à la lumière des résultats décevants des essais cliniques portant sur l’administration directe d’antioxydants comme les vitamines C et E,32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tel que mentionné dans l’introduction, ce document décrit l’utilisation de la microscopie de télévision et artère résistance isolée s’approche pour évaluer la fonction vasculaire non seulement dans les modèles standard de rat (tel qu’employé dans la vidéo), mais aussi en hautement spécialisée génétiquement souches de rats machiné, qui montrent le roman et les aperçus puissants qui peuvent être obtenus en utilisant ces approches. L’utilisation de ces techniques puissantes pour évaluer ton acti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs expriment leurs sincères remerciements à Katie Fink et Lynn Dondlinger pour leur aide précieuse dans la préparation de ce manuscrit.
Subventions : NIH #R21-OD018309 ; #R56-HL065289 ; et #R01-HL128242.
Materials
| SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
| High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
| Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
| Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
| Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
| Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
| Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
| Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
| Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
| Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
| Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
| Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
| Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
| Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
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