En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.
Gıda ağları analiz daha iyi ekosistemler anlamak için önemlidir. Örneğin, gıda web etkileşimleri yerli olmayan türler tarafından işgal kaynaklanan şiddetli değişikliklerin uygulayabilir. Ancak, tam tanımlayıcı alan avcı-av etkileşimlerin çoğu zaman zordur. Bu analizler kez bağırsak içeriğinin görsel bir değerlendirme veya kararlı izotop oranları (δ15N ve δ13C) analizine dayalı. Morfolojik çeşitlilik veya bireysel av organizmalar, av organizmalar tam tanımlaması engelleri önde gelen izotopik imzadan, yaklaşık, sırasıyla, kapsamlı bilgi tür yöntemler gerektirir. Maserasyon, sindirim ve sindirim av organizmalar belirli türler tanımlaması zor yapmak çünkü görsel gut içerik analizleri özellikle yumuşak gövdeli yırtıcı organizmalar, hafife. Bu nedenle, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı stratejiler, örneğin gruba özgü astar kullanımını ayarlar, gıda web etkileşimleri soruşturma için güçlü bir araç sağlar. Burada, nükleer ribozomal deoksiribonükleik asit (rDNA) için gruba özgü astar kümeleri kullanarak alanından macroinvertebrate tüketici gut içeriğini incelemek için ayrıntılı iletişim kurallarını açıklar. DNA olabilir tüm örnekler (söz konusu olduğunda küçük takson) ya da hulâsa ya da bağırsak içeriği alanında toplanan örneklerin dışında. Varlığı ve fonksiyonel etkinlik DNA şablonları doğrudan test bireysel onaylanması gereken evrensel astar kullanarak ayarlar DNA’ın ilgili alt birimi hedefleme. Biz de tüketilen av türler düzeyine PCR ile değiştirilmemiş gruba özgü astar ile daha da polyacrylamide Jeller kullanarak sonraki tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile kombine belirlenebilir göstermek. Ayrıca, biz farklı floresan boyalar etiket olarak DNA parçaları farklı av gruplarının otomatik parça analizi yoluyla birden fazla gut içerik örnekleri için paralel tarama sağlar gösterir.
Trofik etkileşimleri ve gıda web dynamics çoğunluğu teşkil, avcı-av etkileşimleri Cerayanlar madde ve enerji gıda ağları içinde ve ekoloji ana hedeflerinden biri, ekosistemler arasında boyunca karakterize etmek için önemli yönleri vardır 1. kaynak belirlenmesi ve karbon ve besin akışını ekolojik bağlantı ekosistemler2arasında anlayışı sürdürmek. Ancak, ekosistemler nehirler ve onların popülasyonuna gibi sadece tozlar organik madde ve besin aynı zamanda organizmaların3hareketleri bağlantılı değildir. Böylece, bu sistemleri bağlantı kaynak akışının kesintiye uğratmasını habitat değişiklikler şiddetle her iki ekosistemlerin gıda ağları sadece doğrudan ama aynı zamanda dolaylı olarak avcı-av topluluklar ilgili kompozisyon değiştirerek değiştirebilirsiniz. Örneğin, gıda ağları değişiklikleri tek avcı türler (örneğin, gökkuşağı alabalığı)4hareketleri için bağlanacak şekilde gösterilmiştir. Bu tür değişiklikleri potansiyel biyolojik çeşitlilik ve sucul ekosistemler işleyişini tehdit. Bu nedenle, alan avcı-av etkileşimleri analiz su yönetimi uygulamaları, sucul ekosistemlerin doğal biyolojik çeşitlilik gibi insan kaynaklı çevresel değişikliklerin etkisini belirlemek için önemlidir.
Trofik bağlantıları izleme karmaşık sistemlerinde zor olduğu için birkaç yaklaşım bu etkileşimleri alan5‘ te beslenme değerlendirmesi etkinleştirmek kurulmuştur. Geleneksel olarak, araştırmalar alanında etkileşimleri beslenme disseke cesaret av kalıntıları görsel tanımlama temel alır ve morfolojik av çeşitlilik hakkında geniş bir bilgi gerektirir. Görsel gut içerik analizleri anlayışlar kaynak kullanımında tüketiciler (Örneğin, mevsimsel değişimi diyet ıstakoz6 ve balık7,8 ya da beslenme tercihleri kopepodların) çeşitli gruplar hazırladık. Ancak, fiziksel sindirim sürecinin görsel gut içerik analizleri zor yapar ve genellikle yumuşak gövdeli yırtıcı-organizmalar9özlüyor. Türler tarafından sıvı sindirim besleme veya yoğun bir şekilde yemek yeme, solungaçlarınızı gibi önce comminute omurgasız bazı tüketiciler için görsel avcı türlerin bağırsak içeriği imkansız10tanımlamasıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, moleküler analiz umut verici bir alternatif sağlar.
Moleküler analiz şimdi hızlı ve hassas bir av algılama bağırsak içeriği sağlayan ortak bir araç haline gelmiştir. Bu tür teknikler farklı aralığıdır: monoklonal antikorlar veya Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) temel stratejileri sıkça kullanılır, onların yüksek özgüllük ve duyarlılık11yüzünden. Yeni monoklonal antikorlar geliştirme zaman ve maliyet yoğun, antikorlar zaten11mevcut bu nedenle, diğer moleküler tekniklerin uygulanması daha yararlıdır. Başka bir ortak yaklaşım deoksiribonükleik asit (DNA), ribozomal ribonükleik asit (RNA) genleri evrensel astar kullanarak çoğu türler içinde mevcut gibi bölgelerinde amplifikasyon12,13çalıştırabilmenizdir. Bu tekniği kullanırken, sık sık av organizmaların DNA14karışık kaynakları içinde bütün dizi tanımlamak mümkün değildir. Böyle bir dezavantajı önlemek için etkili bir yaklaşım gruba özgü astar kullanmak için genetik gut içerik analizleri için ayarlar olduğunu. Belirli hedef gruplar yalnızca DNA bölgelerinde yükseltmek veya tüm diğer türler15,16çıkartmak için tasarlanmış, gruba özgü astar kimlik belirtilen gruplardan taksonomik düzeyde av organizmaların etkinleştirmek zaman ve maliyet yoğun ikincil analizleri. Ancak, tüm içerik analizi gut gibi bu tür analizleri beslenme davranışı yalnızca anlık görüntü sağlar. Bu nedenle, moleküler gut içerik analizleri zaman entegre doğal tarayıcıları (Örneğin, kararlı izotop) analizleri ile birleştirerek yararlı1,2olarak kabul edilir.
Burada, aynı numune kararlı izotop analizi ile birleştirilmek üzere nükleer ribozomal DNA (rDNA) bölgeleri için gruba özgü astar kümeleri kullanarak avcı-av etkileşimlerin PCR tabanlı araştırmalar için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Biz tek av grupları özel Jel Elektroforez ile DNA tespiti tanımlamak. Ayrıca, daha yüksek taksonomik çözünürlüğe primerler özgüllüğü daha gerekli olduğunda daha da aşağı akım analizleri böyle gruba özgü astar geçerli PCR ürünleri için bir fırsat sunuyoruz. Tek iplikçikli DNA (ssDNA) onların birincil sıra17tarafından belirlenir formu Tersiyer biçimler parçaları çünkü böyle gruba özgü astar tarafından güçlendirilmiş parçaları küçük değişimler konformasyon değişikliklere yol açar. Bu tür değişiklikleri tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile polyacrylamide jeller17,18(tür düzeyine) av organizmaların daha kesin bir kimlik etkinleştirme, tarafından tespit edilebilir.
Özel Jel Elektroforez DNA parçalarının görselleştirmek ve onların yaklaşık uzunluğu19, çözünürlüğünü belirlemek için yaygın ve ucuz bir araç DNA miktarına bağlıdır ve boyama boya20kullanılan iken. Genellikle, görselleştirme yalındır saf DNA örnekleri ile çalışırken olmakla beraber av potansiyel olarak düşük miktarda özel Jel Elektroforez sonuçlarını puanlama DNA tüketici gut içeriğini karmaşık hale getirebilir. Yine de, bu algılama yöntemi alanından tüketici örneklerin düşük bir sayı için bir ekran için uygun veya birkaç grupları av, ama komplikasyon puanlama yapar örnekler çok sayıda tarama için birden çok av takson son derece zaman yoğun ve böylece uygulanamaz. Daha duyarlı bir algılama yöntemi parçaları ayrıca parçaları21tam olarak uzunluğunu tayini sağlar Kapiler Elektroforez ile otomatik analizidir. Birkaç microsatellite dayalı çalışmalar farklı floresan boyalar etiket olarak kullanarak, bu tespit ve karşılaştırılabilir uzunluğu farklı parçaları otomatik parça analizi22,23tarafındanbelirlemek mümkün olduğunu göstermiştir, 24. Bu nedenle, biz de detaylı bir protokol için birden çok av DNA’ın paralel algılama etiketli gruba özgü astar setleri ve algılama otomatik bir sequencer ile otomatik parça analizi yoluyla PCR kullanarak grupları mevcut. Ayrıca, otomatik parça analizi yoluyla av DNA tespiti hafızanın yırtıcı göreli bir miktar da sağlayan bir yaklaşım olduğunu gösteren bir örnek çalışma sonuçları sunmak.
Burada, avcı-av etkileşimler aynı numune moleküler olmayan diğer analizler ile kombine edilebilir rDNA bölgeler için gruba özgü astar ile alan örneklerinden PCR tabanlı tespiti için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ancak, protokol içinde çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, kullanılan astar özgüllük temin esastır. İkinci olarak, mide-bağırsak hazırlanması ve DNA’ın sonraki çıkarma sırasında kontaminasyon ve gut içerik malzeme kaybı önlemek çok önemlidir. Çapraz-…
The authors have nothing to disclose.
Biz Silke Classen Araştırma Enstitüsü’nden ekosistem analizi ve değerlendirmesi (gaiac), bu protokol için kullanılan gruba özgü astar kümeleri kurulmasında yardımını RWTH Aachen için teşekkür ederim. Biz de teşekkür Peter Martin ve Laura Schynawa Kiel Üniversitesi işbirliği için gelen su akarları deneyler. Biz de sorunsuz çalışmasını ve şirketler ve Katalog numaraları kayıt hazırlık lab teknik laboratuar görevlileri tutmak için teşekkür ederiz. Bu eser (DFG; proje GE 2219/3-1) Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
1.5 ml reaction tubes – Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
fuzz-free paper towel | Any | NA | |
Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
Heating Thermoshaker | Any | NA | |
Vortex Mixer | Any | NA | |
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
Microwave | Any | NA | |
Conical flask | Any | NA | |
Measuring cylinder | Any | NA | |
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
Beaker | Any | NA | |
RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
Separation Gel – LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |