Оптимизированный метод LC-MS/MS для высокой пропускной способности анализа клинических образцов Ivacaftor, его основных метаболитов и Lumacaftor в биологических жидкостях больных муковисцидозом
Summary
Сочетание Ivacaftor и ivacaftor-lumacaftor являются два новых препаратов CF. Однако есть еще недостаток понимания их Фармакологических и фармакологии. Мы представляем оптимизированный метод ВЭЖХ-МС для одновременного анализа ivacaftor и его главных метаболитов и lumacaftor.
Abstract
Дефекты в Регулятор проводимости транс мембраны кистозный фиброз (МВТР) являются причиной кистозный фиброз (CF), болезнь с угрожающей жизни легких проявлениях. Ivacaftor (IVA) и ivacaftor-lumacaftor (яркость) комбинации являются два новых прорыв CF лекарств, которые непосредственно модулировать активность и торговля дефектных МВТР-белка. Однако есть еще недостаток понимания на фармакокинетические/фармакодинамика параметров и фармакологии ivacaftor и lumacaftor. Метод ВЭЖХ-МС для одновременного анализа концентрации ivacaftor, гидроксиметил ivacaftor, ivacaftor карбоксилатных и lumacaftor в биологических жидкостях у больных, получавших стандартные комбинации ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor терапия ранее был разработан нашей группы и частично проверяются по стандартам FDA. Однако, чтобы разрешить высок объём анализа большего числа пациентов образцов, наша группа оптимизировал сообщил метод с помощью столбца реверс фаза хроматографии размер меньше поры (2.6 мкм, C8 100 Å; 50 x 2,1 мм) и градиентной жидкостной системы ( 0-1 мин: 40% B; 1-2 мин: 40-70% B; 2-2.7 мин: в 70% B; 2,7-2,8 мин: 70-90% B; 2.8-4.0 мин: 90% B стирки; 4.0-4.1 мин: 90-40% B; 4.1-6.0 мин: в 40% B) вместо Изократические элюции. Целью настоящего исследования было уменьшить время анализа ВЭЖХ-МС на сэмпл резко от ~ 15 мин до только 6 мин на сэмпл, которая необходима для анализа большого количества пациентов образцов. Этот метод целесообразно будет весьма полезными для исследований в воздействие-реакция этих препаратов CF прорыв.
Introduction
Кистозный фиброз (CF) является общим генетическим заболеванием, с участием слизь экзокринной железы легких, печени, поджелудочной железы и кишечника, вызывая прогрессивного мульти полиорганной недостаточности, такие как снижение легочной функции и недостаточность поджелудочной железы1, 2,3. Ivacaftor (IVA) является первым пищевых продуктов и медикаментов (FDA-США) и Европейское агентство лекарственных средств (EMA) одобрил муковисцидоз транс мембраны проводимости регулятор (МВТР) potentiator наркотиков, с свидетельствует клиническая эффективность производства значительного улучшение функции легких над плацебо в небольшого подмножества CF пациентов с учетом G551D-МВТР [глицин (G) в положение 551 заменяется аспарагиновой кислоты (D)] Миссенс-мутации (~ 4-5% из населенности CF)4,5. Это перорально наркотиков увеличивает МВТР канал открытия, тем самым увеличивая поток ионов хлорида и действуя на первичный дефект, который приводит к клинических проявлений CF4,6. К сожалению, IVA монотерапия не эффективен у пациентов с более распространенными гомозиготных F508del мутация [в кадр удаления гена МВТР, что приводит к потере фенилаланин (F) в позиции 508] что приводит смятых МВТР, который рассматривается в ~ 50% CF населения7,8.
Недавно FDA предоставил официальное утверждение для объединения IVA с корректором МВТР lumacaftor наркотиков. Умная стратегия объединения МВТР Корректор (lumacaftor, Лума), который спасает F508del-МВТР на поверхности клеток с модулятором (IVA), который потенцирует активность канала МВТР, эффективно расширяет окна лечения для большинства населения CF5 . Вопросы по-прежнему ли эти препараты будут выполнить свое обещание, как ряд противоречивых докладов появились что сомнение после их клиническая эффективность9,10. Кроме того, улучшение функции легких были лишь скромный (2,6-4% для комбинации ivacaftor-lumacaftor) по сравнению с успех, достигнутый с IVA монотерапии у больных с учетом G551D мутации (10.6-12,5%)8. Потенциальные антагонистических наркотиков-взаимодействиях между IVA и LUMA потенциально ограничивают клиническая эффективность ivacaftor-lumacaftor комбинации приходят от его менее идеальных фармакокинетические свойства7,11. IVA активно метаболизируется ферментами цитохрома P450 (CYP), главным образом в активный метаболит гидроксиметил IVA (IVA-M1, M1) и неактивной форме IVA-карбоксилатных (IVA-M6, M6)7,12. Индуктором CYP3A4 Лума, с другой стороны, широко не метаболизируется и это во многом экскретируется в неизмененном виде в фекалиях11. Как индукторов CYP3A4 вызывают метаболизм цитохрома, ivacaftor (CYP3A4 субстрата) концентрации могут быть сокращены. Кроме того IVA и LUMA очень гидрофобные молекулы и ~ 99% связаны с белками плазмы, что значительно ограничивает свободный (активные) препарата концентрация1,13.
В совокупности эти факторы могут собираются вместе, чтобы ограничить клиническая эффективность комбинации ivacaftor-lumacaftor. Не известно ли оптимальный плазменные концентрации достигаются под текущий режим дозирования для ivacaftor-lumacaftor комбинации или если порог терапевтического сохраняется8. В настоящее время существует нехватка информации о фармакокинетические параметры, такие как пик и концентрации в плазме установившемся ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor. Учитывая отметил метаболизм ivacaftor и lumacaftor, мониторинг воздействия-реакция является условием для достижения оптимальной дозировке схемы для ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor терапии. Наша группа недавно опубликовал первый метод ВЭЖХ/LC-MS для мониторинга воздействия-реакция IVA и LUMA14. До настоящего времени не поступало никаких альтернативных методов измерения концентрации ivacaftor, его метаболитов и lumacaftor. Для высокой пропускной способности анализа больших пациента коллектива и резко уменьшить время анализа, наша группа оптимизированный метод сообщалось с помощью столбца реверс фаза хроматографии размер меньше поры и градиентной жидкостной системы, уменьшает стоимость и время работы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как сообщалось ранее наша группа имеет впервые разработан и проверен метод ВЭЖХ и LC-MS для быстрого обнаружения и количественного определения ivacaftor и его главных метаболитов гидроксиметил IVA M1 (активный) и IVA-карбоксилатных M6 (неактивный); и lumacaftor в плазме крови и мокроты больных CF<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) национальных институтов здравоохранения (R01 AI111965) поддерживаются J.L. и Т.В. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний или национальных институтов здравоохранения. МС является австралийский NHMRC главный научный сотрудник. J. L. австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) старший научный сотрудник, и т.в. Австралийский NHMRC промышленность карьера развития уровня 2 научный сотрудник. E.K.S назначен посол Янг 2017 для ASM (Американское общество микробиологии) и поддерживается австралийских последипломного Award.
Часть этой работы был представлен на 12th Australiasian конференции по муковисцидозом в Мельбурн (5-8го августа 2017).
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
- Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
- Solomon, M., Leatte, P. N. . Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
- O’Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
- Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- FDA. . FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , (2015).
- Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?. Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
- Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297 (2014).
- EMA, . Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
- VERTEX. . Vertex prescribing infomation. , (2015).
- Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
- Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
- Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).
