우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.
인플루엔자 바이러스는 호스트 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력을 전시 한다. 한 가지 방법은 바이러스의 표면 glycoproteins에서 발생 하는 항 원 변화를 통해 이다. 탈출 이체의 세대에 elucidating 바이러스 면역 검출을 탈출 하는 방법을 식별 하는 항 체 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물에 강력한 방법입니다. 여기, 우리 인플루엔자 A 바이러스도 변종 바이러스 성 조류 (HA)에 대 한 감독 또는 murine 단일 클론 항 체 (mAbs)를 이용 하 여 생성 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 기술 사용 하 여 우리는 이전 중요 한 잔류물 머리 나는 새로운 조류 H7N9 하의 줄기를 대상으로 항 체 바인딩을 위한 필요한 특징. 프로토콜은 다른 바이러스 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 탈출 이체의 분석은 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 저항 및 바이러스, 부여 결정 항 원 편 류를 모델링 및 백신 치료제의 설계에 중요 합니다.
다른 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 A 바이러스는 다양 한 항 원 이체 복제1,2,3의 각 라운드의 생성을 허용 하는 오류 중 합 효소를 소유한 다. 인플루엔자 바이러스는 항 체 바인딩의 손실에 지도 하는 표면 glycoproteins에 돌연변이의 축적을 통해 달성 된다 항 원 편 류를 통해 인간의 면역 반응을 회피 하 고 적응 하는 놀라운 능력. 바이러스 성 표면 glycoproteins, 하 및 응집 (NA)의 항 원 편 류를 다르게 매년 백신을 관리 하 고 필요를 필요로 합니다.
격리 및 항 원 특정 항 체의 생성 기술 발전 백신 유도 mAbs4,5,6,,78의 높은 수를 얻지 못했다. 차례로, 인플루엔자 A 바이러스를 광범위 하 게 중화 mAbs의 epitopes의 특성은 크게 주 었 여러 범용 인플루엔자 백신 후보자9,,1011의 개발 12,,1314. mAb의 항 원 발자국 elucidating 중립화의 구조적 결정 요인 밝혀 고 백신 디자인으로 정보 접근에 대 한 수 있습니다. 그러나, 그것은 현실도 구조적으로 바이러스 성 항 원15, 에 epitopes를 지도 하기 위하여 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법을 통해 mAbs의 광범위 한 패널 특성 실험실에 대 한 비용 효율적인 16 , 17 , 18.
엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법 고가의 장비, 전문된 기술 및 잠재적으로 광범위 한 양의 데이터를 생성 하는 시간이 필요 합니다. 대체 하 고 빠른 접근 활용 오류가 RNA 의존을 통해 다양 한 바이러스 인구의 급속 한 세대 mAbs19,20의 epitopes를 결정 하기 위해 탈출 돌연변이 생성에 RNA 중 합 효소 21,,2223. 이스케이프 변종의 생성 어떤 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하지 않는다 고 기존의 실험실 시 약 및 장비와 함께 수행할 수 있습니다.
여기, 인플루엔자 HA를 인식 하는 mAb 바인딩에 필요한 중요 한 잔류물의 매핑 허용 하는 방법을 설명 합니다.
대부분 탈출 돌연변이 통해 식별 된 잔류물의 정확 하 게 되어,이 방법의 주요 주의 사항 중 하나 이지만 탈출 이체의 점 돌연변이 의해 결정 되는 항 체의 분자 풋프린트 내에서 반드시 매핑되지 않을 수 있습니다. 구조 분석입니다. 이것은 원심 allosteric 효과 유사한 돌연변이 잔류물의 위치를 구조적 변화에 지도 하는 특정 잔류물에 돌연변이의 능력 때문 이다. 또 다른 한계는이 방법만 중화 항 체;에 대 한 구현 될 수 있습니다. 항 체를 체 외에서 선택적 압력 부족 돌연변이 탈출 이어질 것입니다. 그러나,이 제한 탈출 변종 이전 특징이 중화 항 체에 의해 생성 된 패널의 사용으로 극복할 수 있습니다. 황갈색 외. H7N9 바이러스를 중화 mAb의 탈출 변형 사용 비 중화 항 체7의 epitope를 지도.
그럼에도 불구 하 고, 탈출 이체의 세대를 통해 항 체의 epitopes를 elucidating 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법, 둘 다 장비의 광범위 한 투자 요구에 대안을 제공 합니다. 다른 대안 mAbs 알라닌 스캔 또는 펩 티 드 스캔/자르기 돌연변이 사용 하 여 최소한의 바인딩 영역을 결정 하는. 알라닌 mutagenesis 스캔 이체의 많은 수를 생성 하는 펩 티 드 검색 하는 것은 선형 epitopes30으로 제한 하는 동안29, 심사 하는 동안에 작업의 상당한 금액을 요구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 아무 특별 한 장비 또는 기술을 요구 하 고 사실, 사용 기존 생체 외에서 중화 분석 관심의 항 체의 탈출 이체를 생성 하도록 수정.
여러 구절 (예를 들어, 스토킹 특정 항 체)를 요구 하는 생성 탈출 변종에 대 한 프로토콜 높은 통로 0 항 체의 시작 농도에 따라 달라 집니다. 그것은 주의 측면에 잘못을 항 체의 절반 최대한 억제 농도 보다 낮은 반 로그에 로그 시작 강력한 바이러스 성장에 대 한 허용을 좋습니다. 연구원 면역 저압의 높은 titer 바이러스 문화 바이러스 인구에서 큰 유전 변이 가질 것 이라고 추측 수 있습니다. 도 이체 다음 구절에서 항 체 농도 점차적으로 증가 하 여 대 한 선택할 수 있습니다. 바이러스 성장 감소, 그 바이러스 상쾌한 양의 이전 구절에서 항 체 농도의 동일한 금액을 유지 하면서 다음 구절에서 늘릴 수 있습니다.
보편적인 인플루엔자 백신의 대부분의 목표는 HA의 스토킹 지역으로 강력한 항 체 응답을 이끌어내는 것 이다. 줄기-특정 항 체를 탈출 이체의 분석은 인플루엔자 바이러스 체력과 면역 압력 사이의 관계를 정의에서 중요 한. 흥미롭게도, 탈출 돌연변이 바이러스 스토킹 관련 mAbs에서 유래한 murine LD50 연구4에서 모든 감쇠 vivo에서 했다. 이러한 연구는 예방 접종 스토킹 기반 플랫폼에 대 한 강한 케이스를 제공합니다. 또한,이 프로토콜 작은 분자 억제제 같은 다른 안티 바이러스 화합물에 탈출 돌연변이 식별 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 마지막으로,이 방법론 인플루엔자 바이러스 표면 glycoproteins에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 바이러스 성 glycoproteins의 epitopes를 결정 하도 더 넓게 적용 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 자금을 일부 알레르기 국립 연구소와 전염병에서 연방 자금, 건강의 국가 학회, 학과의 보건 및 인적 서비스, CEIRS 아래 계약 HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); 그리고 P01AI097092-04S1 (P.E.L.)입니다.
Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |