Мы демонстрируем способ изображения нескольких молекул в гетерогенных наноструктурах с точностью одной молекулы с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентно меченных антител.
Для изображений гетерогенных клеточных структур, использующих одномодовую локализационную микроскопию, препятствовала неадекватная точность локализации и мультиплексирование. Используя флуоресцентные нано-алмазные фидуциальные маркеры, мы описываем процедуры коррекции и выравнивания дрейфа, необходимые для получения высокой точности в одномодовой локализации микроскопии. Кроме того, описана новая стратегия мультиплексирования madSTORM, в которой несколько молекул нацелены в одной и той же клетке с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентных антител. MadSTORM демонстрируется на активированной Т-клетке, чтобы визуализировать расположение различных компонентов в связанной с мембраной структуре с несколькими белками, называемой микрокластером рецепторов Т-клеток. Кроме того, обсуждается применение madSTORM в качестве общего инструмента для визуализации многобелковых структур.
Для преодоления дифракционного предела световой микроскопии (~ 200 нм) были разработаны различные методы микроскопии с высоким разрешением. Среди них – категория методов, называемых одномолекулярной локализационной микроскопией (SMLM), которая включает в себя фотоактивационную локализационную микроскопию (PALM) и стохастическую оптическую реконструктивную микроскопию (STORM). Методы SMLM участвуют в использовании флуорофоров, которые могут переключаться между (флуоресцентными) и выключенными (темными / фотопереключаемыми) состояниями, обеспечивая последовательную локализацию флуоресценции от одиночных молекул 1 , 2 , 3 .
Благодаря совместимости с коммерчески доступными красителями и микроскопами, прямой STORM (dSTORM) стал широко распространенным методом SMLM 4 . DSTORM может регулярно достигать точности локализации ~ 10 нм, определяемой как неопределенность при вычислении центра дифрагированияИонно-ограниченная функция точечного распространения (PSF). Однако, несмотря на высокую точность, оцененную с использованием алгоритмов локализации 5 , 6 , 7 , точное определение фактического расположения отдельных молекул затруднено рядом проблем. Во-первых, механическое перемещение ступени микроскопа во время получения изображения добавляет существенную неопределенность в точность локализации. Поскольку изображения SMLM получены в течение тысяч временных рамок, наномасштабные перемещения ступени микроскопа могут значительно скомпрометировать точность окончательного изображения с высоким разрешением 8 . Чтобы компенсировать перемещение сцены во время захвата изображения, сценический дрейф обычно оценивается на основе регрессионного подгонки локализованных локализаций из самого изображения (кросс-корреляция) или последовательных локализаций из фидуциальных маркеров (коррекция фидуциарных коррекций) 1 , 9 . HowevEr, эти методы требуют оптимизации нескольких параметров для каждого стека изображений и не могут учитывать перемещение ступеней на коротких временных масштабах, таких как механическая вибрация. Золотые наночастицы и многоцветные флуоресцентные гранулы использовались в качестве фидуциальных маркеров в SMLM, но они не являются фотостабильными и приводят к значительно меньшей точности после коррекции дрейфа, чем используемые флуоресцентные наноалмазы (FND) на основе азота В madSTORM 10 .
В дополнение к пределу дифракции световая микроскопия дополнительно ограничена спектральными пределами. Для одновременной визуализации нескольких целей требуются флуоресцентные зонды с неперекрывающимися спектральными профилями, обычно ограничивающие флуоресцентную световую микроскопию до 6 цветов и SMLM до 2-3 цветов 4 , 11 , 12 . Более того, нелинейная хроматическая аберрация вызывает несоосность многоцветных изображений, wДля чего требуются обширные процедуры выравнивания с использованием разноцветных фидуциальных маркеров 8 , 13 . Чтобы преодолеть эти ограничения, в предыдущих исследованиях были отображены множественные мишени с использованием повторного фотообесцвечивания или химического тушения последовательно связанных флуорофоров 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Хотя эти способы могут преодолевать спектральные пределы микроскопии, флуоресцентное отбеливание, как известно, является токсичным процессом 20 , а длительное отбеливание или тушение может вызвать нежелательные побочные эффекты, такие как потеря сшивки. Более того, накопление флуоресцентных зондов может привести к стерической блокировке сайтов связывания в образце, предотвращению крупномасштабного мультиплексирования и надежного нацеливания эпитопов. Чтобы избежать таких стерических помех,Tudy достигло мультиплексирования с использованием стохастического обмена свободно диффундирующих фрагментов белка 21 . В то время как этот метод позволяет плотную маркировку клеточных структур, он требует обширной биохимической подготовки для выделения пептидных фрагментов, не может локализовать положения одной молекулы и не может легко облегчить крупномасштабное мультиплексирование с использованием коммерчески доступных зондов. Мы представляем подробный видео-протокол, описывающий последовательное связывание и элюирование флуоресцентных антител для мультиплексированных изображений с ограниченным размером антител размером dSTORM (madSTORM), а также использование флуоресцентных нано-алмазов для достижения точной коррекции и выравнивания дрейфа.
Процедуры последовательного мультиплексирования, коррекции дрейфа и выравнивания в madSTORM обеспечивают точную, очень мультиплексированную визуализацию гетерогенных структур в клетках. 10 Кроме того, madSTORM избегает ограничений многоцветного STORM, таких как хроматическая абе…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Xufeng Wu за доступ к микроскопу STORM. Это исследование было поддержано Программой внутриутробных исследований Национального онкологического института (NCI) по исследованию рака и Национальным институтом сердца и легких крови (NHLBI).
8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |