Aan de kant van licht komen: In Vivo Monitoring van Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecties in chronische wonden in een diabetische haarloze lymfkliertest Model
Summary
Hier beschrijven we een roman diabetische lymfkliertest model met behulp van haarloze muizen voor real-time, niet-invasieve, bewaking van biofilm wond infecties van bioluminescente Pseudomonas aeruginosa. Deze methode kan worden aangepast aan de infectie van andere bacteriesoorten en genetisch gemodificeerde micro-organismen, met inbegrip van meerdere soorten biofilms, evalueren en testen van de werkzaamheid van antibiofilm strategieën.
Abstract
De aanwezigheid van bacteriën als gestructureerde biofilms in chronische wonden, vooral bij diabetische patiënten, wordt verondersteld om te voorkomen dat de wondgenezing en resolutie. Chronische wonden Muismodellen werden gebruikt om te begrijpen van de onderliggende interacties tussen de micro-organismen en de host. De modellen tot nu toe ontwikkeld, is afhankelijk van het gebruik van harige dieren en terminal collectie van wond weefsel voor bepaling van levensvatbare bacteriën. Terwijl belangrijke inzicht heeft opgedaan met deze modellen, dit experimentele procedure vereist een groot aantal dieren en bemonstering is tijdrovend. We hebben een nieuwe lymfkliertest model waarin verschillende optimale vernieuwingen om te evalueren van biofilm progressie in chronische wonden ontwikkeld: een) maakt gebruik van haarloze muizen, eliminerend de behoefte aan de verwijdering van het laserhaar; b) geldt pre-gevormde biofilms aan de wonden waardoor de onmiddellijke evaluatie van de persistentie en het effect van deze gemeenschappen op host; c) controleert de biofilm progressie door het kwantificeren van lichte productie door een genetisch gemanipuleerde bioluminescente stam van Pseudomonas aeruginosa, waardoor real-time bewaking van de infectie, waardoor het aantal dieren per studie vereist. In dit model is een enkele full-diepte wond geproduceerd op de achterkant van de STZ-geïnduceerde haarloze diabetesmuizen en geënt met biofilms van de P. aeruginosa bioluminescente stam Xen 41. Lichtopbrengst van de wonden wordt dagelijks geregistreerd in een in vivo imaging systeem, waardoor in vivo en in situ snelle biofilm visualisatie en localisatie van biofilm bacteriën binnen de wonden. Deze nieuwe methode is flexibel als het kan worden gebruikt voor andere micro-organismen, met inbegrip van genetisch gemodificeerde soorten en multispecifieke biofilms, studeren en van bijzondere waarde in anti-biofilm teststrategieën met inbegrip van antimicrobiële occlusieve verbanden kan zijn.
Introduction
Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen ingesloten in een matrix van polymere stoffen die zijn gemarkeerd als een bijdragende factor voor de slechte oplossing van chronische wonden1. De studie van deze zeer georganiseerd, persistente microbiële populaties is bijzonder belangrijk voor diabetici, waar slechte circulatie van de ledematen en veranderde perifere sensoriële mechanismen leiden tot onopgemerkt laesies2. In de Verenigde Staten, wordt geschat dat 15% van de diabetespatiënten ten minste één Ulcus in de loop van hun leven ontwikkelt. Dit vertaalt zich naar een economische uitgaven van ongeveer 28 miljard dollar in behandeling3,4, niet te vergeten de immensurable emotionele en sociale lasten. Inzicht in de factoren die het mogelijk maken van microbiële gemeenschappen te volharden in het bed van de wond en de impact van deze biofilms in de helende evenementen is noodzakelijk om te rijden van betere zorg voor de betrokken patiënten en het voortbewegen van de ontwikkeling van nieuwe benaderingen van de behandeling. De oprichting van reproduceerbaar zijn en worden omgezet in vivo modellen voor het verkennen van bacteriële-gastheer interacties staat daarom voorop.
Lymfkliertest modellen hebben met succes ontwikkeld om te bestuderen van de impact van biofilms in chronische wonden. Deze modellen, echter vaak gebruiken haired soorten en evalueren van biofilm goedkeuring door plaat graven voor levensvatbare bacteriële cellen van het verwijderde weefsel van geofferde dieren, waardoor ze tijdrovend en kostbaar.
Een biofotonische alternatief voor de bemonstering van het eindpunt van dieren bij het evalueren van de infectie was voor het eerst voorgesteld door Contag et al. (1995) 5 , die ontwikkelde een methode om vast te leggen van de luminescentie van constitutively bioluminescente Salmonella typhimurium te meten van de effectiviteit van behandeling met antibiotica. Andere studies die profiteren van bioluminescentie uitstotende bacteriën gevolgd. Bijvoorbeeld, Rochetta et al. (2001) 6 gevalideerd een model van de infectie te bestuderen van Escherichia coli dij infecties in muizen door het meten van luminescentie met behulp van een intensievere charge – coupled apparaat en later, Kadurugamuwa et al. (2003) 7 profiteerde van het foton uitstoten van eigenschappen van een gemanipuleerde soort Staphylococcus aureus te onderzoeken van de werkzaamheid van verschillende antibiotica in een katheter wond model in muizen.
De methode die hier gekarakteriseerd presenteert een eenvoudig protocol om te induceren van diabetes in haarloze muizen, produceren en wonden met pre-gevormde bioluminescente biofilms van P. aeruginosa, enten en de uitvoering biofotonische monitoring van de infectie met behulp van een in vivo imaging systeem. Het biedt een directe, snelle, in situ, niet-invasieve en kwantitatieve proces te evalueren van biofilms in chronische wonden en daarnaast staat voor aanvullende analyse zoals microscopische beeldvorming van de genezende wonden, intermitterende bloedinzameling voor cytokine metingen en terminal weefsel collectie voor histologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een nieuw muismodel voor de studie van biofilms in diabetische chronische wonden die heeft vele voordelen om een reproduceerbare, vertaalbare en flexibel model te maken.
De eerste vernieuwing is het gebruik van haarloze muizen. Andere Muismodellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van diabetische chronische wond genezing10,11, maar allemaal hebben vertrouwd op het gebruik van haired muizen waarvoor de afschaffing van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de American Diabetes Association voor de ondersteuning van dit werk (Grant # #7-13-BS-180), de Michigan State University onderzoek ondersteuning Technologiefaciliteit voor het verstrekken van opleidingen en toegang tot de in vivo imaging systeem en de Michigan State University Investigative histopathologisch onderzoek Lab voor de verwerking van de muis biopsieën voor histopathologisch onderzoek.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
