Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.
Lymfkliertest modellen van ziekte is onontbeerlijk voor wetenschappelijk onderzoek. Echter zijn veel diagnostische hulpprogramma’s zoals endoscopie of tomografische imaging niet routinematig gebruikt in diermodellen. Conventionele experimentele uitlezingen is vaak afhankelijk van post-mortem en ex vivo analyses, die intra individuele follow-up onderzoeken te voorkomen en verhogen het aantal studie dieren nodig. Fluorescentie-gemedieerde tomografie kan de niet-invasieve, repetitieve, kwantitatieve, driedimensionale beoordeling van fluorescerende sondes. Het is hoogst-gevoelig en staat het gebruik van moleculaire makers, die het mogelijk voor de specifieke detectie en karakterisatie van verschillende moleculaire targets maakt. In het bijzonder vertegenwoordigen gerichte sondes een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van activering en eiwit expressie van genen in de ontsteking, auto-immune ziekte, infectie, vaatziekten, cel migratie, tumorigenesis, enz. In dit artikel bieden we stapsgewijze instructies op deze geavanceerde imaging technologie voor de in vivo detectie en karakterisering van ontsteking (dat wil zeggen, F4/80-positieve macrofaag infiltratie) in een veelgebruikte lymfkliertest model van darmontstekingen. Deze techniek kan ook worden gebruikt in andere onderzoeksterreinen, zoals immuun cel of een cel van de stam bijhouden.
Dierlijke modellen worden veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek, en vele niet-invasieve procedures bestaan monitor ziekte activiteit en vitaliteit, zoals de kwantificering van veranderingen in het lichaamsgewicht of de analyse van bloed, urine en ontlasting. Echter, deze zijn slechts indirecte surrogaat-parameters die ook onderhevig aan inter-individuele variabiliteit zijn. Ze moeten regelmatig worden aangevuld met post-mortem analyse van weefsel specimen, waardoor seriële observatie op repetitieve tijdstippen en directe observatie van fysiologische of pathologische processen in vivo. Opgedoken verfijnde beeldvormingstechnieken van de kleine dieren, met inbegrip van cross-sectionele imaging en optische beeldvorming, endoscopie, wat mogelijk maakt de directe visualisatie van deze processen en maakt het ook mogelijk voor herhaalde analyses van de dezelfde dieren1 , 2 , 3. bovendien de mogelijkheid om herhaaldelijk volgen verschillende staten van ziekte in hetzelfde dier het aantal dieren nodig, die misschien wel wenselijk is vanuit een oogpunt van dierenethiek kan verkleinen.
Verscheidene verschillende optische beeldvormingstechnieken bestaan voor in vivo fluorescence imaging. Oorspronkelijk werkte confocal imaging te bestuderen van oppervlakte- en ondergrond fluorescerende gebeurtenissen4,5. Onlangs, echter, tomografische systemen waarmee voor kwantitatieve drie-dimensionale weefsel evaluaties zijn ontwikkelde6. Dit is bereikt door de ontwikkeling van fluorescerende sondes die licht in het nabij-infrarood (NIR) spectrum, het aanbieden van de laag absorptie, gevoelige detectoren en monochromatisch lichtbronnen7uitstoten. Terwijl de traditionele cross-sectioning beeldvormingstechnieken, zoals computertomografie (CT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of echografie (VS), meestal afhankelijk van fysieke parameters en visualiseren van morfologie, kan optische beeldvorming bieden aanvullende informatie op onderliggende moleculaire processen sondes met behulp van endogene of exogene TL8.
Vooruitgang in moleculaire biologie hebben bijgedragen tot het vergemakkelijken van de generatie van slimme en gerichte fluorescerende moleculaire sondes voor een toenemend aantal doelstellingen. Bijvoorbeeld kunnen receptor-gemedieerde opname- en distributie in een bepaald doelgebied worden gevisualiseerd met behulp van carbocyanine afgeleide gelabelde antilichamen9. De overvloed aan beschikbare antilichamen, die kan worden aangeduid als specifieke verklikstoffen in anders ontoegankelijke gebieden van het lichaam, biedt ongekende inzichten in de moleculaire en cellulaire processen in modellen van tumorvorming en neurodegeneratieve, cardiovasculaire, immunologische en inflammatoire ziekten7.
In deze studie beschrijven we het gebruik van fluorescentie-gemedieerde tomografie in een lymfkliertest model van colitis. Dextran natriumsulfaat (DSS)-geïnduceerde colitis is een standaard chemisch geïnduceerde muismodel van darmontstekingen strekking inflammatory bowel disease (IBD)10. Het is vooral handig voor de beoordeling van de bijdrage van het aangeboren immuunsysteem aan de ontwikkeling van darm ontsteking11. Aangezien de aanwerving, activering en infiltratie van monocyten en macrofagen vertegenwoordigen cruciale stappen in de pathogenese van IBD, zijn visualisatie van hun aanwerving en de kinetiek van infiltratie essentieel voor de monitoring, bijvoorbeeld het effect van potentiële therapeutische stoffen in een preklinische instelling12. We beschrijven de inductie van DSS colitis en tonen de tomografie-gemedieerde karakterisering van macrofaag infiltratie in de mucosa van de darm met behulp van fluorescentie moleculaire tomografie voor de specifieke visualisatie van de monocyt/macrofaag markering F4/80 13. Daarnaast illustreren we ondersteunende en aanvullende procedures, zoals het antilichaam etikettering; de experimentele opzet; en analyse en interpretatie van de verkregen beelden, in correlatie met conventionele uitlezingen zoals ziekte activiteit indexen, stromen cytometry en histologische analyse en immunohistochemistry. We bespreken de beperkingen van deze techniek en vergelijkingen met andere beeldvormende modaliteiten.
Hoewel medische beeldvormingstechnieken zijn snel geëvolueerd in de afgelopen jaren, zijn we nog steeds beperkt in onze capaciteit om te ontdekken van inflammatoire processen of tumoren, evenals andere ziekten, in hun vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is echter cruciaal begrip tumorgroei, invasie, of metastasen ontwikkeling en cellulaire processen in de ontwikkeling van inflammatoire aandoeningen en immunologische, degeneratieve en cardiovasculaire ziekten. Terwijl de traditionele beeldvormingstechnieken is afhankel…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken mevrouw Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber en Mrs. Klaudia Niepagenkämper voor de uitstekende technische bijstand.
Reagents | |||
Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |