Summary

Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

Published: April 12, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo refinado para efetivamente revelar biotinilado amina de dextrano (BDA) rotulagem com uma fluorescente método através de um caminho neural recíproco de coloração. É apropriado para analisar a estrutura fina do BDA, rotulagem e distinguindo-a das outros elementos neurais sob microscópio confocal laser.

Abstract

Amina de dextrano de biotinilado de alto peso molecular (BDA) tem sido usada como um marcador altamente sensível neuroanatômica por muitas décadas. Desde que a qualidade da sua rotulagem foi afetada por vários fatores, aqui, nós fornecemos um protocolo refinado para a aplicação de alto peso molecular BDA para estudar a rotulagem neural ideal no sistema nervoso central. Após a injeção estereotáxica de BDA para o núcleo ventral póstero-medial (VPM) do tálamo em ratos através de uma pipeta de vidro delicado, BDA foi manchado com fluorescente streptavidin-Alexa (AF) 594 e counterstained com fluorescente Nissl mancha AF500/525. Sobre o fundo de coloração de Nissl do verde, o vermelho BDA etiquetando, incluindo organismos de célula neuronais e axonal terminais, mais distintamente foi demonstrada no córtex somatossensorial. Além disso, a dupla coloração fluorescente para BDA e o parvalbumin de proteína ligadora de cálcio (PV) foi realizado para observar a correlação de BDA rotular e interneurônios PV-positivas no destino cortical, proporcionando a oportunidade de estudar o local neural circuitos e suas características químicas. Assim, este método refinado não só é adequado para a visualização de alta qualidade neural de rotulagem com o alto peso molecular BDA através de vias neurais recíprocas entre o tálamo e o córtex cerebral, mas também permitirá a simultânea demonstração de outros marcadores neurais com fluorescente histoquímica ou imunoquímica.

Introduction

Alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular), um marcador altamente sensível, tem sido utilizado para rastreamento de vias neurais no sistema nervoso central por mais de 20 anos1. Embora o uso do BDA é um trato neural comum técnica de rastreamento, a qualidade da rotulagem BDA pode ser afetada em animais por vários fatores1,2,3. Nosso estudo recente indicou que a estrutura ideal do BDA rotulagem é não só associada com um tempo de sobrevivência de pós-injeção adequada, mas também correlacionada com a coloração do método4. Até agora, convencional complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC), isotiocianato de fluoresceína-streptavidin e streptavidin-AF594 coloração métodos foram usados para revelar a rotulagem BDA em estudos anteriores2,3, 4,5. Em comparação, a coloração fluorescente para BDA pode ser facilmente executada.

A fim de estender a aplicação de alto peso molecular, BDA, um protocolo refinado foi introduzido no presente estudo. Após a injeção do BDA para a VPM do tálamo em cérebro de ratos, BDA rotulagem foi revelada pelo método regular de coloração padrão do ABC, bem como manchando duplo fluorescente, que foi realizado para observar a correlação da BDA rotulagem e básico elementos neurais ou interneurônios no destino cortical com streptavidin-AF594 e histoquímica de Nissl fluorescente ou PV-imunoquímica, respectivamente. Através de vias neurais recíprocas entre VPM e o córtex somatossensorial primário (S1)6,7,8, focamos nossa observação na BDA rotulagem nos axônios thalamocortical projetada e corticothalamic somas de célula projetada em S1. Por este processo, que esperávamos fornecer não somente um protocolo detalhado para a obtenção da alta qualidade da rotulagem neural com alto peso molecular BDA, mas também um protocolo refinado sobre a combinação de rotulagem de BDA fluorescente e outros marcadores fluorescentes neurais com histoquímica ou imunoquímica. Esta abordagem é preferível estudar os circuitos neurais locais e suas características químicas sob um laser confocal, microscopia eletrônica de varredura.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em China Academy de chinês ciências médicas (número de referência 20160014). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Quatro ratos macho adulto (250-280 g de peso) foram utilizados neste estudo. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com umidade e temperatura controlada e permitiu o livre acess…

Representative Results

Sobrevivência da injeção de pós 10 dias da BDA para o VPM foi suficiente para produzir intenso neural rotulagem nas áreas corticais correspondentes ipsilateral ao lado de injeção (Figura 2). ABC convencional e fluorescentes mancha procedimentos para BDA revelaram o padrão semelhante de rotulagem neural sobre a S1, incluindo anterogradely rotulado thalamocortical axônios e rotulado retrogradely corticothalamic neurônios (Figura 2…

Discussion

Selecionar um traçador adequado é um passo fundamental para uma experiência bem sucedida de rastreamento neural. Na família de BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) foi recomendado preferencialmente ser transportado pela via anterógrada neural em contraste com baixo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)2,3 , 11 , 12 , 13. no entanto, mu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (projeto código n º 81373557; n. º 81403327).

Materials

Biotinylated dextran amine (BDA) Molecular Probes D1956 10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594 Molecular Probes S32356 Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain Molecular Probes N21480 Protect from light
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Confocal imaging Olympus FV1200
system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Sprague Dawley Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-4000
superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm
Photoshop and Illustration Adobe CS5

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Cite This Article
Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang, Z., She, C., Bai, W. Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat. J. Vis. Exp. (134), e55938, doi:10.3791/55938 (2018).

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