מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.
חרקים פיתחו מערכות מתוחכמות של קליטת חוש הריח לחוש אותות כימיים אקסוגניים. אלה האותות הכימיים הם transduced על ידי נוירונים קולטן חוש הריח (ORNs) שוכנים במבנים דמויי שיער, המכונה chemosensilla, של האנטנות. על קרום של ORN, Odorant קולטנים (ORs) הם האמינו להיות מעורב ריחוף ריח. לפיכך, היכולת לזהות גנים הממוקמים ל- ORN נחוצה כדי לזהות גנים, ומספקת בסיס יסודי לתפקוד תפקודי נוסף באתרו . רמות ביטוי RNA של ספציפיים או S אנטנות חרקים הם נמוכים מאוד, ושימור רקמות חרקים עבור היסטולוגיה מאתגרת. לכן, קשה למקם OR לסוג מסוים של sensilla באמצעות RNA ב הכלאה באתרו . במאמר זה, רנ"א מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו במיוחד עבור גנים לידי ביטוי נמוך של חרקים, הוא הציג. בנוסף, או ספציפי גןS זוהה על ידי ביצוע ניאון פעמיים צבע ניסויי הכלאה באתרו באמצעות שיתוף קולטן ביטוי קולטן, אורקו , כסמן.
אנטנות חרקים, שהן האיברים הכימוזנריים החשובים ביותר, מכוסים במבנים רבים דמויי שיער – הנקראים סנסיליה – המושרשים על ידי נוירונים של קולטן חוש הריח (ORN). על הממברנה של חרקים ORN, רצפטורים אודורנט (ORs), סוג של חלבון המכיל שבעה תחומים transmembrane, באים לידי ביטוי עם corceptor (ORCO) כדי ליצור heteromer המתפקד כמו ערוץ יון מלוטש יון 1 , 2 , 3 . ORs שונים מגיבים לשילובים שונים של חומרים כימיים 4 , 5 , 6 .
ארבה ( Locusta migratoria ) בעיקר להסתמך על רמזים חוש הריח כדי להפעיל התנהגויות חשובות 7 . ORS ארבה הם גורמים מרכזיים להבנת מנגנוני הריח המולקולריים. לוקליזציה של ארבה או גן ספציפי לנוירון שלמורפולוגית ספציפית סוג sensillum על ידי RNA ב הכלאה Situ (RNA ISH) הוא הצעד הראשון בחקר הפונקציה ORs.
רנ"א משתמשת בדיקה מסומנת RNA משלים למדוד ולמקם רצף מסוים RNA בסעיף של רקמות, תאים או mounts כולו באתרם , מתן תובנות תהליכים פיזיולוגיים מחלה פתוגנזה. Digoxigenin שכותרתו (DIG שכותרתו) ו ביוטין שכותרתו בדיקות RNA כבר בשימוש נרחב הכלאה RNA. RNA תיוג עם digoxigenin-11-UTP או biotin-16-UTP יכול להיות מוכן על ידי שעתוק במבחנה עם SP6 ו T7 RNA פולימריות. DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יש את היתרונות הבאים: לא רדיואקטיבי; בטוח; יַצִיב; רגיש מאוד; ספציפיים מאוד; וקל לייצר באמצעות PCR ו שעתוק במבחנה . DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות chromogenically ו זוהה fluorescently. DIG שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אלקלי דיגוקסגנין אנטיNe-phosphatase (AP) נוגדנים conjugated כי ניתן לדמיין גם עם המצעים chemiluminescent רגיש nitroblue tetrazolium כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine מלח (NBT / BCIP) באמצעות מיקרוסקופ אופטי או עם 2 הידרוקסיה -3-naphtoic חומצה -2 '-phenylanilide פוספט (HNPP) יחד עם 4-chloro-2-methylbenzenediazonium חמי אבץ כלוריד מלח (אדום מהיר) באמצעות מיקרוסקופ confocal. Biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אנטי ביוטין streptavidin צנון סוס צחצוח Peroxidase (HRP) – conjugated נוגדנים שיכולים להיות דמיינו עם tyramides פלואורסצין באמצעות מיקרוסקופ confocal. לכן, פעמיים צבע פלואורסצנט הכלאה באתרו יכול להתבצע כדי לזהות שני גנים היעד בפרוסה אחת באמצעות בדיקות DIG ו ביוטין שכותרתו RNA.
RNA ISH עם DIG- ו / או בדיקות שכותרתו ביוטין שימש בהצלחה למקם גנים ההרחה הקשורות, כגון OR, ionotropic קולטן, חלבון odorant מחייבואת החלבון נוירון חישה, ב אנטנות חרקים של, אך לא רק, תסיסנית melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria ואת ארבה המדבר Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . עם זאת, ישנם שני אתגרים משמעותיים בעת ביצוע RNA ISH עבור חרקים ORS: (1) או גנים (למעט ORCO ) באים לידי ביטוי ברמות נמוכות ורק במספר תאים, מה שהופך זיהוי האות קשה מאוד, (2) שימור רקמת חרקים עבור היסטולוגיה, כך שהמורפולוגיה נשמרת ורעש הרקע נמוך, יכול להיות מאתגר. במאמר זה פרוטוקול מפורט ויעיל המתאר RNA ISH עבור לוקליזציה או גנים חרקיםאנטנות מוצג, כולל הן Chromogenic ו Tyramide איתות הגברה (TSA) גילוי.
זה קשה לבצע RNA ISH כדי למקם או גנים אנטנות חרקים בגלל רמות ביטוי של גנים או, למעט ORCO , הם נמוכים מאוד ושמירה פרוסות היסטולוגית של אנטנות חרקים קשה מאוד. בנוסף, זיהוי TSA הוא גם מאוד מסובך. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנקוט בצעדים הבאים. האנטנות נבחרות מתוך ארבה מבוגר החדש שי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.31472037). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואין פירושו המלצה.
Materials | |||
2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
T Vector | Promega, USA | A362A | |
T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | |||
1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instrument | |||
Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |