Análise do Gap Junction-dependente Transferência de miARN com 3D-FRAP Microscopia
Summary
Aqui, descrevemos a aplicação da recuperação de fluorescência tridimensional após o fotobleaching (3D-FRAP) para a análise do deslocamento dependente da junção de miARN. Em contraste com os métodos comumente aplicados, o 3D-FRAP permite a quantificação da transferência intercelular de pequenos RNAs em tempo real, com alta resolução espaço-temporal.
Abstract
Os pequenos ARNs antisentidos, como o miARN e o siRNA, desempenham um papel importante na fisiologia celular e na patologia e, além disso, podem ser utilizados como agentes terapêuticos no tratamento de diversas doenças. O desenvolvimento de novas estratégias inovadoras para a terapia com miARN / siRNA é baseado em um amplo conhecimento dos mecanismos subjacentes. Dados recentes sugerem que os pequenos RNAs são trocados entre as células de uma maneira dependente da junção de lacunas, induzindo os efeitos reguladores de genes na célula receptora. Técnicas biológicas moleculares e análise citométrica de fluxo são comumente usadas para estudar a troca intercelular de miARN. No entanto, esses métodos não fornecem alta resolução temporal, o que é necessário ao estudar o fluxo juncional de gap das moléculas. Portanto, para investigar o impacto do miARN / siRNA como moléculas de sinalização intercelular, são necessárias novas ferramentas que permitirão a análise desses pequenos RNAs no nível celular. O presente protocolo descreve o apPlicação da recuperação de fluorescência tridimensional após microscopia de fotoblanqueamento (3D-FRAP) para elucidar a troca de moléculas de miARN entre as células cardíacas dependentes da junção gap. É importante ressaltar que esta abordagem direta e não invasiva de imagens de células vivas permite a visualização e quantificação do deslocamento de junção de RNA pequenos com marcação fluorescente em tempo real, com alta resolução espaço-temporal. Os dados obtidos por 3D-FRAP confirmam uma nova via de regulação de genes intercelulares, onde os pequenos RNAs atuam como moléculas de sinalização dentro da rede intercelular.
Introduction
Os pequenos RNAs não codificados são jogadores importantes na regulação de genes celulares. Estas moléculas são compostas por 20-25 nucleótidos que se ligam a um mRNA alvo específico, levando ao bloqueio da tradução ou à degradação mRNA 1 , 2 . O processo de regulação de genes realizado por pequenos RNAs, como o miARN e siRNA, é um mecanismo altamente conservado que foi encontrado em muitas espécies diferentes 3 . Em particular, as moléculas de miARN são de importância crucial para uma variedade de processos fisiológicos, incluindo proliferação, diferenciação e regeneração 4 , 5 . Além disso, a desregulação da expressão de miARN é atribuída a muitas doenças patológicas. Correspondentemente, os miRNAs demonstraram ser adequados como biomarcadores para o diagnóstico e como agentes terapêuticos para terapia genética 6 , 7 </suP>.
As junções de abertura (GJs) são estruturas de proteínas especializadas na membrana plasmática de duas células adjacentes que permitem a troca difusional de moléculas com um peso molecular de até 1 kD. Eles mostraram ser importantes para o desenvolvimento de tecidos, diferenciação, morte celular e distúrbios patológicos, como câncer ou doença cardiovascular 8 , 9 , 10 . Várias moléculas foram descritas como capazes de atravessar canais GJ, incluindo íons, metabólitos e nucleotídeos. Curiosamente, GJs também foram encontrados para fornecer um caminho para o movimento intercelular de pequenos RNAs 11 , 12 . Assim, os miRNAs podem atuar não apenas dentro da célula em que são produzidos, mas também dentro das células receptoras. Isso destaca o papel dos miRNAs no sistema de transdução de sinal intercelular. Ao mesmo tempo, os dados demonstramEssa comunicação intercelular juncional gap está intimamente ligada à função miRNA. Devido ao impacto significativo do miARN e do GJ na homeostase, na patologia e no diagnóstico de tecido, uma compreensão abrangente da função dos GJ e da dinâmica intercelular relacionada do miARN ajudará a esclarecer os mecanismos das doenças baseadas em miARN e a desenvolver novas estratégias para Terapias de miRNA.
Dependendo da extensão do acoplamento juncional gap, a transferência de moléculas de miARN entre as células pode ser um processo muito rápido. Portanto, é necessária uma metodologia que permita a visualização e quantificação do movimento intercelular rápido dessas moléculas de sinalização regulatória. Comumente, as técnicas de citometria de fluxo e biologia molecular foram aplicadas para demonstrar o transporte de pequenos RNAs 11 , 12 , 13 , 14 . No entanto, ao contrário dos micros FRAPCopiar, essas abordagens não possuem alta resolução temporal, o que é obrigatório ao analisar a troca de miRNA via GJs. Além disso, o microscópio FRAP é menos invasivo e, portanto, representa uma poderosa e nova técnica de imagem de células vivas para avaliar a troca dependente de GJ de moléculas em vários tipos de células 15 , 16 , 17 .
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo a aplicação de 3D-FRAP para avaliar a transferência de miARN entre cardiomiócitos. Para este fim, os cardiomiócitos foram transfectados com miARN marcado fluorescentemente. Uma célula marcada com este miRNA foi fotobleached, e o reentensign de miARN juncional de junção de células adjacentes foi registrado de maneira dependente do tempo. A alta resolução temporal de experiências FRAP oferece a possibilidade de realizar estudos cinéticos para a avaliação precisa da transferência intercelular de miARN e siARN entre células vivas. MoreoComo os pequenos RNAs podem ser trocados através de mecanismos diferentes com cinética altamente diferente, o microscópio FRAP pode ajudar a esclarecer até que ponto os GJs estão envolvidos nos respectivos processos de shuttling 18 . Além disso, 3D-FRAP pode ser usado para investigar alterações fisiológicas e patológicas na permeabilidade GJ e seu impacto na transferência de RNA pequena 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Os miRNAs são atores-chave na fisiologia celular e demonstraram que atuam como moléculas de sinalização usando-entre outros – GJs como um caminho para a troca intercelular 11 , 12 , 22 . O protocolo atual apresenta uma técnica de imagem de células vivas in vitro para caracterizar esta rodovia dependente de GJ usando miARNs fluorescentes dentro dos clusters celulares.
O protocolo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa da Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o Estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com Fundos Estruturais da UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), o DFG (DA1296-1) e a Fundação Alemã do Coração (F / 01/12). Além disso, o RD é suportado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade Rostock (889001), a Fundação DAMP e o BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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