本発明者らは、味覚コーディングを研究する3つの新しい方法を提示する。単純な動物、 Manduca sexta( Manduca )を用いて、解剖プロトコール、複数の味覚受容体ニューロンの活動を記録するための細胞外テロドールの使用、および味物質の正確なタイミングパルスの送達および監視のためのシステムを記載する。
味覚は動物が環境中の化学物質を検出することを可能にし、生存に不可欠な行動を引き起こします。味覚受容器ニューロン(GRN)が味覚分子を検出すると、脳内のフォロワーニューロンに伝播する電気活動のパターンとして、味覚物質の同一性および濃度に関する情報をコード化する。これらのパターンは味物質の内部表現を構成し、動物が行動を選択して記憶を形成することを可能にする。比較的単純な動物モデルの使用は、感覚コーディングにおける基本原則を研究するための強力なツールであった。ここでは、moth Manduca sextaを用いて練習コーディングを研究する3つの新しい方法を提案する。まず、軸索からのGRNの活性を記録することを可能にする、上顎神経および食道下領域(SEZ)を暴露するための解剖処置を提示する。第2に、細胞外電極を使用して、複数のGRNの活性を記録することを記載する上顎神経に直接ワイヤを通す。第3に、我々は、高い時間精度で異なる味物質のパルスを送達および監視するための新しいシステムを提示する。これらの方法は、味物質が送達される前、中および後で、GRNからのインビボでのニューロン応答の特性決定を直接的に可能にする。複数のGRNから記録された電圧トレースの例を示し、個々のニューロンの応答を特定するためにスパイクソート手法をデータにどのように適用できるかの例を示します。最後に、本発明者らの記録方法を検証するために、GRNから得られた細胞外記録をテトロドと比較し、シャープなガラス電極で得られた細胞内記録と比較する。
味覚システムと嗅覚システムは、環境中の化学物質の内部表現を生成し、それぞれ味覚と臭気の認識を生じさせる。これらの化学感覚は、仲間や食事の発見から捕食者や毒素の回避に至るまで、生物の生存に不可欠な多くの行動を引き出すために不可欠です。プロセスは、環境化学物質が感覚受容細胞の原形質膜に位置する受容体と相互作用するときに始まる。これらの細胞は、直接またはニューロンとの相互作用を介して、化学物質の同一性および濃度に関する情報を電気信号に変換する。これらの信号は、高次のニューロンや他の脳構造に伝達されます。これらのステップが進むにつれて、元の信号は、感覚情報を検出し、識別し、分類し、比較し記憶し、適切な行動を選択する生物の能力を促進する変化を常に受ける。ブラジャーの仕組みを理解する環境化学物質に関する情報を変換することで、さまざまな作業を最善に実行することが、神経科学の基本的な問題です。
味覚コーディングは、比較的単純であると考えられている。味を引き出すすべての化学分子(「味覚」)は、約5またはそれ以下の基本味質( すなわち、甘味、苦味、酸味)塩味、うま味) 1 。この「基本的な味」の観点では、味覚システムの仕事は、これらの基本的な嗜好のどれが存在するかを判断することです。さらに、神経系における基本的な味覚表現の根底にある神経機構は不明であり、「標識された線」2,3,4,5,6または「繊維横断パターン」 7によって支配されると考えられている</sup> 、 8コード。標識されたラインコードでは、各感覚細胞およびその神経フォロアーの各々は、単一の味質に反応し、一緒にその味に特化した中枢神経系のより高い処理中心への直接かつ独立した経路を形成する。対照的に、横繊維パターンコードでは、各感覚細胞は複数の味覚特性に応答して、味覚物質に関する情報が感覚ニューロンの集団全体の応答によって表される。味覚情報が基本的な嗜好であるかどうかにかかわらず、ラベルされた線を介して、または他の何らかのメカニズムによって、不明瞭であり、最近の調査の焦点である3,8,9,10,11,12。私たちの最近の研究は、味覚システムが時空間集団コードを使って基本的な味のカテゴリーではなく個々の味の表現10 。
ここでは、味覚コーディングの研究を支援する3つの新しいツールを提供します。まず、味覚の電気生理学的研究に適した比較的単純なモデル生物としてのハクモス・マンジュカ・セクスタの使用を示唆し、解剖処置を記述する。次に、個々のGRNの活動を記録するために細胞外の「四極管」を使用することを提案します。第3に、我々は動物に正確に時間を合わせた鼓動を届けるための新しい装置を提案する。これらのツールは、私たちの研究室や他の研究者が嗅覚システムを研究するために使用した技術から適応されました。
ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster )、イナゴミツバチ ( Mist Manduca sexta)などの昆虫は、何十年もの間、ナルについての基本原則を理解するための強力な資源を提供してきた感覚コーディング( 例えば、嗅覚13 )を含む大脳系。哺乳動物において、味覚受容体は、複雑なセカンドメッセンジャー経路を介してニューロンと通信する特殊細胞である。昆虫ではより簡単です。味覚受容体はニューロンです。さらに、周辺の哺乳類の味覚経路は、比較的複雑であり、複数の平行な神経経路を特徴とし、重要な構成要素は、小さな骨構造15に含まれるアクセスするのが難しい。昆虫の味の経路はより単純に見える。昆虫では、GRNは、アンテナ、口、翼および脚16,17に位置する、感覚器として知られる特殊な構造に含まれている。 GRNは、副食道ゾーン(SEZ)に直接投影され、その役割は主に味覚17と考えられており、2次味覚ニューロン10 。そこから情報が身体に届いて反射神経を駆動し、より高い脳領域に統合され、記憶され、最終的に行動選択肢を駆動する16 。
味覚情報がどのように伝播され、神経系全体にわたってポイントからポイントに変換されるのかを理解するために、末梢味覚応答を特徴付けることが必要である。昆虫におけるGRNの神経活動を直接的にモニターする最も一般的に使用される方法は、先端記録技術である12,18,19,20,21,22,23である。これは、感知器の上に電極を直接配置することを含み、その多くはアクセスが比較的容易である。味物質は電極内に含まれており、活性化および延長が可能であるsensillumにおけるGRNsのニューロン応答を測定する。しかし、味物質が電極に含まれているので、味物質が送達される前または除去された後にGRN活性を測定すること、または電極20を交換することなく味物質を交換することは不可能である。別の方法である「サイドウォール」記録技術も、GRNの活動を記録するために使用されている。ここでは、味覚センサ24の基部に記録電極を挿入し、味覚センサの先端にある別のガラスキャピラリを介して味物質を供給している。両方の技術は、GRNから特定の感覚器への記録を制限する。ここでは、新しいテクニックを提案します:異なる感覚器からの無作為に選択されたGRN軸索からの記録、別々に嗅覚器に一連の味覚物質を送達すること。軸索記録は、軸索を運ぶ神経に鋭利なガラス電極または細胞外電極束(四極管)を配置することによって達成されるSEZ 10への鼻腔内のGRN。 Manducaでは、これらの軸索は純粋に求心性であることが知られている上顎神経を横断し、感覚反応の明瞭な記録を可能にする25 。軸索から記録するこの方法は、一連の味わいのあるプレゼンテーションの前、中および後に、2時間以上にわたって、GRN応答の安定した測定を可能にする。
ここでは、SEZと一緒に上顎神経を曝露するための解剖手順を説明します。これにより、SEZ 10内の複数のGRNおよびニューロンの応答を同時に記録することができます。また、スパイクソート法と組み合わせると複数のGRNを同時に解析することができるカスタムメイドの4チャネルツイストワイヤーテトロードを使用したGRNの細胞外記録の使用についても説明します。我々はさらに、テトロドで作製した記録を、鋭い細胞内で作製した記録と比較する電極。最後に、味覚刺激を提供する新しい装置について説明する。多くの研究者が嗅覚研究で匂い物質を送達するために長い間使用されてきた装置から適応されたこの新しい装置は、咀嚼研究の利点を提供します:Stürckowらが開発した従来のマルチチャンネル送達システム(参考文献26,27参照)このタイミングの電圧読み出しを提供しながら、味のある供給のタイミングを制御する。それは複数の味覚刺激10の迅速で連続的な送達を可能にする。装置は、一定の流量の清浄な水の中に鼻腔を浸し、制御された耳の鼓動を送達することができる。それぞれの鼓動は頸部を通過して洗い流されます。味は味のない食べ物の着色を少量含んでおり、正確なタイミングで味わいのあるov鼻腔があります。
本明細書に記載の方法は、比較的単純な動物Manduca sextaからのインビボでの記録が、長期間にわたって(2時間以上)、味覚送達の前、最中および後に複数の無作為に選択されたGRNの活性を特徴付けることを可能にする。これらの方法はまた、正確な時間制御を有する複数の味覚刺激の迅速で連続的な送達を可能にし、味覚表現の基礎となる神経機構を研究するのに有用である。このプロトコルは、シナプス後の標的ニューロン( 例えば、 SEZ)に伝達されたときにGRNを単シナプスで接続された介在ニューロンと同時にモニタリングすることによって、GRNの味物質への応答がどのように変化するかを研究するために用いられているさらに、これらの方法は、実験者のニーズに適合させることができ、複雑なパラダイムの実行が味覚コーディングの基本的な側面を研究することを可能にする。
beginnin私たちの研究では、トラブルシューティングが必要な技術的な問題の1つは、四極線で上顎神経からのスパイク信号を検出できないことでした。この解剖プロトコールは困難であり、良好な準備を得るためにはいくつかのプラクティスが必要であるため、これに対する考えられる原因は多様である。第1に、蛾の解剖の間、上顎神経は、特に神経組織を取り囲むシースの除去中に損傷することが容易である。第2に、シースが完全に除去されない場合、四極線は神経にアクセスできない可能性がある。どちらの場合も、新しい準備を開始することは、これらの問題を解決する最も簡単な方法です。第三に、四極ワイヤに問題があるかもしれない。これは、1kHzで〜270kΩになるはずのワイヤのインピーダンスを測定することによって確認できます。インピーダンス値が〜300kΩを超える場合は、ワイヤを金で電気めっきして、所望のインピーダンスにします(参考文献30を参照)。第4に、機器が誤って接続されている可能性がありますまたは誤動作。
別の考えられる問題は、スパイク信号が記録されるがニューロンは味物質に応答しないように見えることである。これは、記録されたニューロンが、送達された味覚物質のセットに対して感受性がないためであり得る。また、GRNの軸索に加えて、上顎神経もまた、機械感覚線維を運ぶことを覚えておくことが重要である。したがって、GRNの代わりに、またはGRNに加えて、機械感覚ニューロンから記録することが可能である。しかしながら、味のある送達システムは実験を通じて一定の機械的入力を提供するように設計されているため、味物質に対する応答は送達の機械的構成要素に対する応答によって混乱することはない。いくつかの他の味覚物質に反応するニューロン、または異なる味物質に異なる方法で応答するニューロンは、GRNとして明白に分類することができる。化合物の分解または蒸発による味物質濃度または組成の変動を避けるために、新たに希釈した味物質を使用することを推奨しますの溶媒を含む。また、チューブの汚れや詰まりを避けるため、システムを定期的に清掃することをお勧めします。
別の可能な技術的問題は、不利な信号対雑音比である。この問題は、しばしば、浴の接地電極の位置を再塩素化または調整することによって解決することができる。他の解決策では、装置内の各電気的接続の長さを遮蔽し最小限に抑える必要があるかもしれない。
最後に、テトロード記録を使用して得られたデータの正確な分析には注意深いスパイクソートが必要であることに注意することが重要です。我々は、完全自動化された方法は一般的に不十分であることを発見した。四極データ10,29,31,32,33を分析する前に、スパイクソートの文献に精通することをお勧めします。
私たちの解剖プロの代替トコールを使用することができます。ここでは、蛾の頭の腹側部分を切開し、上顎神経およびSEZへのアクセスを提供するが、背側を通ってこれらの構造にアクセスすることも可能である。私たちは背側の準備が深い場所のためにこれらの味覚構造から録音するのに最適ではないことを発見しましたが、この準備はマッシュルーム本体のような高次構造からの録音を可能にする利点を提供します感覚統合、連合学習、記憶処理34 。我々は、上顎神経から記録するために四極電極の使用に焦点を当ててきたが、図示のように、標準的な細胞内の鋭い電極もこの目的のために使用することができる。さらに、両方の技術を組み合わせて、複数の脳領域10からの同時記録を行うことができる。神経科学文献には、昆虫と脊椎動物の両方35,36,37,38,39 に適用される、嗅覚コーディングのような感覚処理の基本原理を明らかにするための強力なツールであることが証明された無脊椎動物モデル。私たちのメソッドが味覚コーディングについての基本的な新しい洞察につながることを願っています。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、NIH-NICHDからMSへの教室グラントによってサポートされました.NATH-NIMH Instrumentation Core FacilityのG. DoldとT. Talbotに感謝の意を表します。
Dissection and specimen preparation | |||
Polypropylene tube, 15 ml -Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2" | MONOJET | 888200144 | For aplying air to remove the hair from the moth. |
Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
Petri dish-100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
Pipette tip (1-200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
Electric waxer | Almore International | 66000 | |
Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervious tissue. |
Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
Epoxy | Permatex | 84101 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline perfusion system | |||
Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastant delivery system | |||
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories. |
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor . |
Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Electrophysiology Equipment | |||
D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode . |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastants | |||
KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |