Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.
Viele Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, wurden durch die Verwendung einfacher Verhaltenstests in Modellorganismen wie der Fruchtfliege , Drosophila melanogaster , aufgeklärt . Drosophila ist nützlich für das Verständnis der grundlegenden Neurobiologie, die kognitiven Defiziten zugrunde liegt, die sich aus Mutationen in Genen ergeben, die mit menschlichen kognitiven Störungen wie der intellektuellen Behinderung (ID) und dem Autismus assoziiert sind. Diese Arbeit beschreibt eine Methodik für das Testen von Lernen und Gedächtnis mit einem klassischen Paradigma in Drosophila bekannt als Balz Konditionierung. Männliche Fliegen Hof Frauen mit einem deutlichen Muster von leicht erkennbaren Verhaltensweisen. Vorzeitige Frauen sind nicht empfänglich für die Paarung und werden die männlichen Kopulationsversuche ablehnen. Als Reaktion auf diese Ablehnung reduzieren männliche Fliegen ihre Balzverhalten. Diese gelehrte Verringerung des Balzverhaltens wird im Laufe der Zeit gemessen und dient als Indikator für Lernen und Gedächtnis. Das GrundniveauRical output dieses Assays ist der Balzindex (CI), der als der Prozentsatz der Zeit definiert ist, die ein Mann während einer 10-minütigen Intervall-Kurve verbringt. Der Lernindex (LI) ist die relative Reduktion von CI in Fliegen, die einer vorzeitigen Frau im Vergleich zu naiven Fliegen ohne vorherige soziale Begegnungen ausgesetzt waren. Für den statistischen Vergleich von LIs zwischen Genotypen wird ein Randomisierungstest mit Bootstrapping verwendet. Um zu veranschaulichen, wie der Assay verwendet werden kann, um die Rolle eines Gens in Bezug auf Lernen und Gedächtnis zu adressieren, wurde hier der panneuronale Knockdown von Dihydroxyacetonphosphat-Acyltransferase ( Dhap-at ) charakterisiert. Das menschliche Orthologe von Dhap-at , Glyceronphosphat O-Acyltransferase ( GNPT ), ist an rhizomelic chondrodysplasia punctata Typ 2 beteiligt, ein autosomal-rezessives Syndrom, das durch eine schwere ID gekennzeichnet ist. Mit dem Courtship Conditioning Assay wurde festgestellt, dass Dhap-at für Langzeitgedächtnis benötigt wird, aber nicht fürKurzzeitgedächtnis. Dieses Ergebnis dient als Grundlage für die weitere Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.
Die molekularen Mechanismen, die Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, sind in vielen Arten konserviert. Die Pionierarbeit Screening Drosophila Melanogaster Mutanten Linien für Defekte in olfaktorischen Lernen und Gedächtnis hat wichtige molekulare Einblicke in die Prozesse zugrunde liegenden Lernen und Gedächtnis 1 . Diese Studien identifizierten einige der ersten Gene, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt waren, wie Rutabaga 2 , Amnesiac 3 und Dunce 4 , was eine kritische Rolle für die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) -Signalisierung 5 enthielt.
Frühe genetische Bildschirme für Gedächtnismutanten wurden hauptsächlich mit olfaktorischer Konditionierung durchgeführt. Allerdings sind mehrere Methoden zur Messung anderer Formen des Lernens und des Gedächtnisses im Laufe der Zeit entstanden. Eines der am weitesten verbreiteten Lern- und Speicherparadigmen und der hier beschriebene Assay ist bekannt als cDie erstmals von Siegel und Halle 6 beschrieben wurde und später von mehreren anderen Forschungsgruppen 7 , 8 , 9 verfeinert wurde. Die Courtship-Konditionierung hängt von der Anwesenheit eines spezifischen Pheromons, cis- Vcciosylacetat (cVA), auf dem weiblichen Bauch, der von der männlichen während der Kopulation hinterlegt wird. Das Erfassen von cVA auf den weiblichen Bauch verringert natürlich das Balzverhalten, und wenn es mit dem Akt der Ablehnung durch das Weibchen gekoppelt ist, wird die Wirkung von cVA auf die Verringerung der männlichen Balz dramatisch verbessert. Die Antwort von männlichen Fliegen in diesem Assay kann leicht durch Beobachtung ihres ausgeprägten Balzverhaltens, das durch die Orientierung auf und nach dem weiblichen, Klopfen, Ausdehnen und Vibrieren des Flügels, Lecken und Versuchen der Kopulation 10 ( Fig. 1A ) gekennzeichnet ist, quantifiziert werden. Männliche Fliegen lernen zu unterscheiden H zwischen rezeptiver jungfräulicher und nicht-rezeptiver gepaarter Weibchen 11 , und nach sexueller Ablehnung zeigen sie das reduzierte Balzverhalten gegenüber nicht-rezeptiven Frauen für bis zu 9 Tage 8 . Dieses natürliche Verhalten kann verwendet werden, um die Mechanismen, die dem Lernen, dem Kurzzeitgedächtnis (STM) und dem Langzeitgedächtnis (LTM) 8 , 9 , 12 zugrunde liegen, zu erhellen. Lernen ist definiert als die sofortige Verringerung des Balzverhaltens, die während des Trainingszeitraums auftritt und wird oft als sofortiger Rückrufspeicher bezeichnet, gemessen 0 – 30 min nach Exposition gegenüber einer gepaarten Frau 6 , 8 . STM wird zwischen 30 min und 1 h nach dem Training gemessen, während LTM am häufigsten 24 h nach dem Training 8 gemessen wird ( Abbildung 1B ). STM kann mit einer 1-h Trainingsphase induziert werden, aber es dauert nur 2-3 StundenS = "xref"> 6 , 8 . In den meisten Lernparadigmen kann LTM nur durch beabstandete Kämpfe des wiederholten Trainings induziert werden. Mcbride et al . (1999) 8 zeigte, dass drei beabstandete 1-stündige Trainingseinheiten ausreichen, um eine Balance für bis zu 9 Tage zu induzieren, im Gegensatz zu den 2-3 Stunden, die durch eine einzelne 1-h-Trainingseinheit induziert wurden. McBride et al . 8 zeigte auch, dass eine einzelne 5-h-Trainingseinheit eine ähnliche LTM-Antwort für bis zu 9 Tage produzierte. Fliegen behaupten nicht ständig während dieser 5-Stunden-Periode, in der Tat produzieren ihre eigenen beabstandeten Training zu induzieren LTM in einer einzigen Trainingseinheit. Dies ist aus praktischer Perspektive sehr wichtig, was die Leichtigkeit, mit der dieser Assay zur Untersuchung von LTM verwendet werden kann, erheblich erhöht. Aktuelle Protokolle verwenden überwiegend eine einzige Trainingseinheit von 7-h für LTM 11 , 12 . Mehrere Studien haben verschiedene untersuchtMutanten Bedingungen, die spezifische Mängel in verschiedenen Aspekten der Balz Lernen haben. Zum Beispiel, Pilz Körperablation betrifft STM und LTM, aber nicht lernen 8 . Mutationen im amnesischen Gen, die zuerst als spezifischer Regulator des Gedächtnisses unter Verwendung der olfaktorischen Konditionierung 3 definiert wurden, beeinflussen den STM, aber nicht das Lernen 6 . Störung des Translationsreglers orb2 (oo18 RNA-bindende (orb) CPEB2-Unterfamilie) und Ecdyson-Signalisierung exklusiv Effekt LTM 9 , 13 . So ist die Balzkonditionierung ein nützliches Paradigma, um die Mechanismen, die den verschiedenen Stufen des Lernens und Gedächtnisses zugrunde liegen, zu sezieren.
Diese Arbeit zeigt einen optimierten experimentellen Aufbau, der die relativ hohe Durchsatzprüfung der Balzkonditionierung ermöglicht. Darüber hinaus beschreibt es ein statistisches Analyse-Skript und diskutiert kritische Faktoren des Assays. Es ist shHier ist das Drosophila- Gen Dihydroxyaceton-Phosphat-Acyltransferase ( Dhap-at ) Ist in Neuronen für LTM erforderlich, aber nicht für STM. Das menschliche Orthologe dieses Gens, Glyceronphosphat O-Acyltransferase ( GNPAT ), ist in rhizomelic chondrodysplasia punctata Typ 2 14 mutiert, eine autosomal-rezessive Störung, die durch schwere intellektuelle Behinderung, Krampfanfälle und mehrere andere klinische Merkmale gekennzeichnet ist. In diesem Kontext kann die Konditionierung der Justiz zur funktionellen Validierung der Rolle von menschlichen Krankheitsgenen in Lernen und Gedächtnis genutzt werden, was eine Grundlage für mechanistische Studien bildet.
Der Courtship Conditioning Assay ist ein klassisches Paradigma für die Analyse von Lernen und Gedächtnis in Drosophila . Das hier vorgestellte Protokoll folgt der oben beschriebenen allgemeinen Methodik 6 , 7 , 8 , 9 , enthält aber auch einzigartige Aspekte wie praktische Leitlinien, Fachgeräte und ein Datenanalyse-Skript 9 , 12 für Randomisierungstests. Mit diesem Protokoll ist es möglich, eine große Anzahl von Fliegen parallel mit 96-Well-Flat-Bottom-Blöcken zu analysieren ( Abbildung 2A ), um Männer zu sammeln und zu trainieren. Die Blöcke sind mit PCR-Klebefolie versiegelt, was die Fliegen bei Bedarf leicht zugänglich macht. Darüber hinaus erlauben die hier beschriebenen eindeutigen Balkenkammern die gleichzeitige Paarung von 18 männlich-weiblichen Paaren in einem fast zweidimensionalen Raum, den iS optimal für die Videoanalyse. Die kundenspezifischen Balkenkammern sind einfach zu bedienen und ein Bauplan ist vorgesehen ( Datei S1 , Abbildung 2D ). Dieses Protokoll, von der Erstellung der Kulturen, die zum Sammeln von Testpersonen zur Erfassung von Videodaten verwendet werden, dauert etwa 20 Tage ( Tabelle 1 ). Für die Analyse von Videodaten ist eine zusätzliche Zeit erforderlich. Nach unserer Erfahrung ist der STM-Test äußerst robust. Der LTM-Assay ist auch ziemlich robust, aber es ist empfindlicher gegenüber verwechslungsreichen Umgebungsvariablen und kann daher schwerer zu meistern sein.
Tierisches Verhalten kann sehr variabel sein. Daher müssen kritische Schritte im Protokoll mit Sorgfalt durchgeführt werden, um diese Varianz zu reduzieren. Zuerst wird die sanfte Verwendung des Saugers ( Bild 2B ) die Belastung verringern, die durch eine grobe Handhabung oder durch zu starkes Ausblasen verursacht werden kann. Eine vorgeschlagene Methode zur Übertragung von EinzelpersonenFliegt aus dem aspirator ist mit negativen geotaxis. Als Fliegen dazu neigen, aufzustehen, kann man einfach die Spitze des Aspirators nach oben zeigen; Kurz bevor die Fliege die Spitze erreicht, reicht ein sanfter Schlag aus, um die Fliege auszulassen. Darüber hinaus, um die Männer in die Balzkammern vor dem Testen zu lassen, ist ein Schlag oft nicht notwendig.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Sammlung und Generierung von männlichen Testpersonen. Alle Männer müssen gesammelt werden, wenn sie sehr jung und sozial naiv sind. Dies kann durch häufige Erhebung während der Spitzenzeiten der Eklosion erreicht werden (Schritt 5.2). Wenn Männer nicht in diesem engen Zeitrahmen gesammelt werden, können sie frühe soziale Interaktionen haben, die zu einem schlechten Lernen oder einer hohen Variabilität in CI führen können. Ein weiterer Faktor der männlichen Testpersonen, die beurteilt werden sollten, ist der genetische Hintergrund. Verschiedene genetische Hintergründe zeigen unterschiedliche Ebenen der naiven Balz und können sich auch in der allgemeinen Aktivität oder Bewegungsfähigkeit unterscheiden. Wenn compaRing mehrere Genotypen, Pflege sollte in Bezug auf genetischen Hintergrund genommen werden, um diese verstörenden Faktoren, die LI-Scores beeinflussen können, zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Verteilung der CI-Daten sorgfältig beurteilt werden. CI-Daten können sowohl parametrisch als auch nicht parametrisch sein, abhängig vom Genotyp oder anderen Umgebungsfaktoren. In einigen Fällen, wenn die Verteilung von CI drastisch weg von einer normalen Verteilung entfernt ist, kann es besser sein, den Median-CI zu verwenden, anstatt den Mittelwert für die Berechnung von LIs. Nach unserer Erfahrung macht die Verwendung von medianem oder mittlerem CI jedoch keinen Unterschied in der statistischen Interpretation der Daten, und die Verwendung des mittleren CI ist die übliche Praxis in der Literatur.
Für eine erfolgreiche Balzkonditionierung ist die aktive Ablehnung von männlichen Balzversuchen durch vorgebrachte Frauen während der Trainingszeit entscheidend. Es ist wichtig zu gewährleisten, dass die vorangegangenen Frauen in diesem Assay verwendet wurden effizient verpaart und sindDamit keine Kopulation. Diese Vormischung wird in den zusammenpassenden Fläschchen hergestellt, die in Schritt 4 hergestellt wurden, wo männliche und weibliche Fliegen für 4 Tage zusammengehalten werden ( Tabelle 1 ). Anschließend kann die Paarung durch regelmäßige Prüfung von Testvideos und durch Beobachtung von männlich-weiblichen Paaren während des Trainings überwacht werden. Wenn eine Paarung stattfindet, gibt es mehrere Maßnahmen, die bei der Vorbereitung von vorgedrungenen Weibchen eingenommen werden können. Zuerst sollten vorzeitige Frauen unter optimalen Zuchtbedingungen aufgezogen werden. Phiolen können mit Hefepaste und einem gefalteten Filterpapier ergänzt werden, um die potentiellen Gegenflächen zu vergrößern. Die Inkubation von Fliegen unter den hier beschriebenen Bedingungen hat in der Vergangenheit robuste vorgebildete Weibchen hervorgebracht, aber dies kann in verschiedenen Labors und unter Verwendung unterschiedlicher genetischer Belastungen variieren. Daher kann es notwendig sein, die Erzeugung von vorgedrungenen Weibchen durch Variieren der Inkubationszeit und -bedingungen zu optimieren.
Quantifizierung des Balzverhaltens istEin weiterer kritischer Schritt in diesem Protokoll. Dies kann manuell oder automatisch mit spezialisierten Softwareprogrammen erfolgen 9 . Automatisierte Quantifizierung ist schnell und grundsätzlich unvoreingenommen. Mehrere Programme wurden veröffentlicht 21 , 22 , 23 ; Allerdings sind sie nicht einfach zu bedienen, oft erfordert spezielle Video-Formate und erweiterte rechnerische Fähigkeiten. Manuelle Quantifizierung ist einfach und präzise, aber es ist sehr arbeitsintensiv und unterliegt individueller Variabilität und Bias. Es ist wichtig zu betonen, dass dieses Protokoll nicht die Anforderungen an die Videoformatierung adressiert, die möglicherweise für die automatisierte Quantifizierung von CIs erforderlich sind. Für manuelle Quantifizierung, verwenden Sie alle einfachen Video-Aufnahme-Gerät, das das Potenzial hat, ein Video von ausreichender Qualität zu produzieren, um genau zu beobachten, Balz Verhalten. Für die automatisierte Quantifizierung wird es wahrscheinlich anders seinAnforderungen abhängig von der verwendeten Software, und die Benutzer sollten dies gründlich untersuchen, wenn eine automatisierte Quantifizierung gewünscht wird.
In Kombination mit den umfangreichen Werkzeugen, die für die genetische Manipulation von Fliegen zur Verfügung stehen, bietet der Courtship Conditioning Assay eine robuste Auslesung, die verwendet werden kann, um molekulare Mechanismen und neuronale Netzwerke, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, zu sezieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir bestätigen das Wiener Drosophila Resource Center für die Bereitstellung der Drosophila- Stämme. Zusätzlich wurden in dieser Studie Bestände aus der Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) verwendet. Diese Forschung wurde teilweise durch das großflächige integrierte Netzwerk Gencodys der KP, HvB und AS sowie die NSERC Discovery und CIHR Project Grants an JMK unterstützt
P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
Razor blade | – | – | Any sharp will do |
Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
power food | |||
Agar | Sigma | A7002 | |
Yeast | Bruggeman | – | |
Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
Peptone | Sigma | P6838 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – | ||
Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
normal food | |||
Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
Yeast | bruggeman | – | |
Corn flour | de Molen | – | |
Sugar | de Molen | – | |
Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
Demineralized water | – |