이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜 설명 그대로 상부 기도 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링을 합니다. 그것은 또한 기도 국 소 면역 서명, 자극 절차 (종종 다른 기술에서 사용)에 대 한 필요 없이 연구에 대 한 유체 있다 면역 중재자의 분석 전에 사용 추출 절차를 자세히 설명 합니다. 점 막 내벽 액체 필터 종이의 스트립에 샘플링 비와 흡수의 2 분 왼쪽 열 등의 앞쪽 부분에 배치. Analytes는 eluted 필터 논문에서 그리고 추출 된 단백질 기반 있다 동일한 샘플에 낮은 및 높은 레벨 analytes의 높은 감도 정량화에 대 한 수는 electrochemiluminescence 기반 immunoassay에 의해 분석 된다. 상부 기도 점 막에 통로 신호 하는 특정 면역에 관련 된 20 미리 면역 중재자의 비보에 레벨 측정 하지만 기술은 그 특정 패널 또는 샘플링 사이트에 국한 되지 않습니다. 기술은 처음 알레르기 비 염으로 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에 7 세 어린이 천식에 코펜하겐 예비 연구에서 구현 되었습니다. 그것은 그 후 경도 COPSAC2010 출생 코 호트, 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년에와에서 급성 호흡기 증상의 경우에에서 사용 되었다. 우리는 성공적으로 얻은 및 700 1 개월 어린이의 620 (89%)에서 샘플을 분석; (중간값 (간 사분 위 수 범위 (IQR))로 보고 분석 결과 검출 한계 아래 몇 가지 샘플 했다 합니다. 각 중재자에 대 한 검출 한계 (즉, 0에서 탐지의 낮은 제한 세트 포인트를) 아래에 샘플의 번호 29 (7.25-119.5) 이었다. 이 기술은 수 에 비보 기도 점 막 면역 프로 파일의 출생에서 정량화, 경도, 적용 될 수 있다 그리고 유전학 및 초기 생활 환경 노출, 이상, endotyping, 및 호흡기 질환, 그리고 개발 및 새로운 치료제의 평가의 효과 대 한 연구에 적용할 수 있습니다.
코의 점 막 내벽 액체 위 기도 시스템의 액체 부분을 게. 복잡 한 매트릭스 상피와 미생물 침입에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 구성 하는 면역 세포 사이 상호 작용에서 파생 하는 중재자의 그것에 의하여 이루어져 있다. 비 강 점 막이 쉽게 접근할 수 있는, 그리고 코와 기관지1사이의 강력한 기능과 면역 관계 있다. 이 구획은 어린 시절에, 인생에서 나중에 더 널리 다른 호흡기 질환의 범위 뿐만 아니라 천식과 알레르기 비 염 등 일반적인 기도 질병에 관하여 특별 한 관심의 이다.
여기, 우리는 샘플 그대로 점 막 비 강에서 액체를 안 감 후속 추출 절차 뿐 아니라 필터 종이, 비 침 투 적인 기법을 사용 하 여, 하는 데 사용 그들의 정량화 하기 전에 필터 논문에서 단백질 기반 analytes elute 메서드의 구현을 설명 합니다. 이 기술은 예를 들어 vivo에서 모두 건강 한 개인과 다양 한 호흡기 질환과 개인의 면역 시그니처를 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 면역 서명에 대 한 중요성의 노출을 확인 하 고 예측 또는 중재자 나중 질병 개발의 경우 평가를 가능 하다.
점 막 내벽 액체 이전 코 게2는 종종 앞 코 도전 테스트는 알레르기 염증 반응을3,4자극을 높은 수준에서 소개 된다에 의해 획득 되었습니다 했다. 그러나, 코 게 기술은 어린 아이에서 가능 하지 않습니다 하 고 수준 분석 결과5의 검출 한계 보다 낮을 수 있습니다 희석된 중재자로 서, 결과 혼동 한다 한 알 수 없는 희석 요소를 소개 합니다. 또한,이 알 수 없는 희석 요인 때문 코 도전 테스트에서 측정 된 실정이 응답 설정 일대에 코 게 기술의 유용성을 제한 함으로써 개인 간의 비교 되지 않습니다. 마지막으로, 알레르기 도전만 민감하게 과목에 적용 이며 히 스타 민 도전 등 기타 문제는 순수, 잠재적으로 중재자 릴리스에 천장 효과 일으키는. 이러한 문제는 어디 체액과 분석 수준을 개별 분 비 간 개별 분산에 영향을 주는 유일한 요소는 점 막 내벽 유체 컬렉션에 대 한 표시 필터 종이 기반 기술에서 피할.
추출 프로시저 동안 analytes는 eluted 필터 논문에서 버퍼의 동일한 볼륨의 추가 후 모든 샘플. 이 모든 샘플의 비슷한 비보 전 희석 하시 더군요. 알 부 민-기반 isotonic 소금 솔루션의 추출 버퍼 추출 단계;에 사용 그것은 단백질 기반 중재자의 추출 가능 하 게 하 고 단백질 제한 이후 동결 중 정량화 이전 eluted 단백질의 변성을 안정 시킨다. 추출 단계 단백질 저하를 방지 하려면 protease 억제제의 칵테일 추출 버퍼에 추가 됩니다.
그대로, vivo에서정량화를 허용 하는 기술의 구현-점 막 사이트에서 생성 된 면역 중재자는 최대 중요성 이다. 첫째, 점 막 사이트는 신체에서 가장 큰 면역 기관 최대 수 있습니다. 둘째, 코 위치 공중 노출의 주 사이트 이며1폐 호흡기 면역 구획에 밀접 하 게 연결 된. 셋째, 비 침 투 적인 기법으로이 중요 한 장기를 측량의 가능성 건강과 질병 기도에 관하여 중요 한 미생물 면역 상호 작용 축에 과다 한 정보를 제공 하는 가능성을 엽니다. 넷째, 약물과 미 량 영양소의 무작위로 고르 곤, 통제 된 실험에서 로컬 면역학 변경 공부 등이 기술의 다른 많은 가능한 응용 프로그램 있다.
우리 처음 우리 7 세 어린이 건강 한 컨트롤13대 알레르기 비 염으로 점 막 내벽 액체의 면역 프로필을 결정 하는 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에에 코펜하겐 예비 연구에의 기술 구현. 그 후, 우리가 성공적으로 적용이 기술을 경도 COPSAC2010 코 호트 및 평가 기도 면역 프로필에 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년 및 급성 호흡기 증상의 인스턴스. 1 개월 된 신생아 결과 면역 서명 및 초기 생활 환경 노출7,8,9,10,,1112사이 중요 한 연결을 설명 했다.
여기에 제시 된 기술로, vivo에서 위 기도 점 막 면역 프로필 1 개월 이전 완료 하지 않은 나이 일찍부터 어린이 확인할 수 있었습니다. 우리는 신생아의 기도 면역 프로필에 특정 기도 박테리아의 그 존재와 感7,11, 뿐 아니라 다른 전과 perinatal 노출, 미러 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 높은 복용량 비타민 d의 무작위 미 량 재판의 행동의 메커니즘을…
The authors have nothing to disclose.
우리는 어린이 가족 COPSAC2010 코 호트 연구의 그들의 지원 및 헌신에 대 한 우리의 감사를 표현 한다. 우리는 인정 하 고 COPSAC 연구 팀과 cytokines와 발산의 측정 기술자 Lisbeth Buus Rosholm, 덴마크의 기술 대학에서에서 기술 도움의 독특한 노력을 주셔서 감사 합니다.
Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |