Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.
O desenvolvimento normal da glândula mamária pode ser alterado pela exposição a substâncias tóxicas ambientais e produtos farmacêuticos, exposição excessiva a hormonas e alterações genéticas. As montagens inteiras da glândula mamária são um método barato para capturar a progressão das alterações morfológicas que podem surgir após a exposição. No entanto, na vida posterior, quando as anormalidades são mais propensas a desenvolver, a única dependência deste método pode nem sempre fornecer informações suficientes para fazer um diagnóstico adequado da anormalidade. Historicamente, em estudos de diretrizes de teste químico, uma única glândula mamária é removida na necropsia e preparada como uma seção mantida com hematoxilina e eosina (H & E). A incorporação de coleta e análise de mamíferos contralaterais inteiros diminui a probabilidade de uma avaliação falso-negativa. A avaliação de todo o suporte é limitada pela presença de uma ou duas glândulas mamárias inteiras em um slide e, em alguns casos, as anormalidades observadas em todo o suporte não sãoT uniformemente representado na seção H & E. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo para a conversão de montagens completas mamárias revestidas em seções manchadas de H & E para que as lesões que de outra forma tenham sido perdidas ou que sejam difíceis de diagnosticar possam ser identificadas. Aqui, detalhamos um método para produzir uma seção de H & E integrada em parafina de alta qualidade de uma glândula mamária que inicialmente foi preparada como uma montagem total. Em comparação com um tecido que foi intencionalmente preparado para seção de H & E, todo o suporte requer preparação adicional para remoção e processamento de tecido. No entanto, este método é considerado barato, uma vez que requer reagentes de laboratório comuns e pouco tempo adicional. Como resultado, este método pode fornecer informações inestimáveis sobre como as exposições químicas e ambientais alteram o desenvolvimento mamário normal, bem como exibir mudanças que ocorrem devido a modificações genéticas.
O mountis completo mamário é um método útil e barato implementado em muitos estudos de ratos e ratos para entender o desenvolvimento anormal e induzido quimicamente. Em geral, uma glândula mamária coletada em vários estágios durante o desenvolvimento de roedores ( ou seja, adolescência, puberdade, gestação média e tardia e fase de involução) mostrará mudanças morfológicas na arquitetura celular e celular influenciada por fatores paracrinos, endócrinos e autocrinos 1 . No rato envelhecido, as porções epiteliais e estromadas da glândula tornam-se cada vez mais densas, o que dificulta a medição de parâmetros morfológicos em um monte inteiro. Assim, é prática comum coletar uma glândula para avaliação histológica para identificar mudanças em um nível microscópico. Ambos os processos são especialmente úteis em estudos envolvendo exposição química ( ou seja, ambiental ou farmacêutico) ou para examinar as alterações morfológicas acompanhadas de alterações genéticasAções.
Técnicas e capacidades para usar a glândula mamária na avaliação de risco continuam a evoluir. Embora a preparação de montagem total seja rotineira e padronizada, as modificações na seção continuam 2 , 3 . Muitos grupos de pesquisa de diferentes origens ( ie, academia, governo e indústria) adaptaram as seções coronal / longitudinal do tecido mamário como um método preferido, enquanto alguns laboratórios ainda usam cortes transversais através da pele 4 . O último método resulta em uma representação desordenada da epiderme (pele), em vez do tecido de interesse: o epitélio da glândula mamária 2 . As seções coronais ou longitudinais são mais úteis para caracterizar o tecido normal 5 e melhoram muito a detecção de anormalidades e lesões devido ao aumento da área de superfície e ao número de estruturas presentes. No geral, isso faz com que todo o mundoNão é um método adequado para a avaliação histopatológica comparativa da glândula mamária 1 , 2 . Quer usando um ratinho ou um rato, a recuperação e a conservação do 4 e 5 de gânglios inguinais é altamente recomendada para a comparação do conjunto de montagem para uma secção contralateral H & E.
Quando usado em combinação, a seção H & E e a montagem total fornecem uma conta precisa das mudanças celulares e morfológicas induzidas pela exposição ambiental. Isto é especialmente verdadeiro em certas cepas de roedores nas quais o modelo possui uma baixa susceptibilidade à formação de tumor ou um tumor não é visivelmente visível. Em algumas circunstâncias, a obtenção do tecido necessário nem sempre é possível usando ambas as técnicas ( ou seja, quantidade de tecido insuficiente, recursos ou resultados experimentais inesperados). No nosso caso, observaram-se anormalidades no conjunto total mamário, enquanto o histopathoOs achados lógicos na glândula contrárea H & E foram na sua maioria normais. A discrepância esmagadora entre as glândulas contralaterais nos levou a desenvolver um procedimento econômico e eficiente para identificar as anormalidades em toda a montagem. Utilizando um procedimento de processamento e incorporação modificado, foram preparadas secções coloridas com H & E de alta qualidade a partir de montagens inteiras integradas em parafina. Imaginamos que este protocolo se torne uma poderosa ferramenta de detecção para efeitos de exposição química, aumentando as comparações entre laboratórios.
A montagem completa da glândula mamária é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para ilustrar o desenvolvimento mamário normal e as alterações morfológicas que podem surgir e persistir após a exposição a produtos químicos, incluindo os disruptores endócrinos. Quando uma montagem completa e a seção H & E do mesmo animal são avaliadas em conjunto, elas podem fornecer uma imagem instantânea precisa de alterações precoces, que podem avançar para um estado mais doente.
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The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, por sua experiência técnica e suporte com este projeto.
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |