Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti
Summary
L'obiettivo del presente studio è stato quello di sviluppare e convalidare la potenza e la sicurezza del recettore genico mediato dal virus 9 associato ad adeno associato a spina (AAV9) utilizzando una nuova tecnica di somministrazione del gene subpiale nei topi adulti.
Abstract
Lo sviluppo efficace di una tecnica sub-adenosa associata a virus 9 (AAV9) in ratti e suini adulti è stata riportata in precedenza. Utilizzando cateteri in polietilene (PE-10 o PE-5) posizionati subpiamente per la consegna AAV9, è stata dimostrata un'espressione potente di transgene attraverso il parenchima spinale (materia bianca e grigia) nei segmenti spinali sottomarmente iniettati. A causa della vasta gamma di modelli di topi transgenici delle malattie neurodegenerative, esiste un forte desiderio per lo sviluppo di una tecnica di erogazione del vettore per il sistema nervoso centrale (CNS) potente nei topi adulti. Di conseguenza, il presente studio descrive lo sviluppo di un dispositivo di erogazione del subpiale spinale e la tecnica per consentire una consegna sicura ed efficace della AAV9 spinale in topi adulti C57BL / 6J. Nei topi spinalmente immobilizzati e anestetizzati, il pia mater (livello segmentale spinale 1 e lombare 1-2) è stato inciso con un ago tagliente a 34 G utilizzando un manipolatore XYZ. Un secondo XYZ maIl nipulatore è stato quindi usato per avanzare un ago a punta 36G nello spazio subpiale lombare e / o cervicale. Il vettore AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copie genomiche (gc)) che codifica la proteina verde fluorescente (GFP) è stato quindi iniettato subpially. Dopo le iniezioni, la funzione neurologica (motoria e sensoriale) è stata valutata periodicamente e gli animali sono stati perfezionati 14 giorni dopo la consegna di AAV9 con 4% di paraformaldeide. L'analisi delle sezioni spinali orizzontali o trasversali ha mostrato un'espressione transgena in tutto il midollo spinale, sia in materia grigia che bianca. Inoltre, l'espressione di GFP mediata retrogradely-mediata è stata osservata negli assoni e nei neuroni del motore discendente nella corteccia del motore, nucleo ruber e formio reticularis. Nessun disfunzione neurologica è stata osservata in tutti gli animali. Questi dati mostrano che la tecnica di somministrazione del vettore subpiale può essere utilizzata con successo in topi adulti, senza causare lesioni del midollo spinale correlate alla procedura ed è associata ad un espresso transgene altamente potenteSione per tutta la neurazzia spinale.
Introduction
L'uso di vettori AAV per il trattamento di una varietà di disturbi neurodegenerativi del midollo spinale e del CNS sta diventando una piattaforma ben accolta per aumentare o distogliere in modo efficace l'espressione di gene di interesse. Una delle limitazioni fondamentali per l'utilizzo più efficace di questa tecnologia per trattare i disturbi del midollo spinale è la limitata capacità di fornire vettori AAV al cervello profondo o al parenchima del midollo spinale nei mammiferi adulti.
È stato dimostrato, ad esempio, che la somministrazione sistemica di AAV9 nei roditori adulti, nei gatti o nei primati non umani è solo moderatamente efficace nell'indurre l'espressione di transgeni nei neuroni nel cervello e nel midollo spinale 1 , 2 , 3 . Inoltre, è stato dimostrato che l'erogazione intratheca più efficace dei vettori AAV9 porta ad un'espressione limitata di transgeni nelle piscine anatomicamente definite di neuroni. Più in particolare, sono stati demoniLa consegna intratraca AAV9 cisternica o lumbo-sacrale in primati, maiali o roditori non umani porta ad un elevato livello di espressione di transgene nei motonieuronali spinali e nei neuroni gangliari della radice dorsale segmentale. Tuttavia, espressione minima o nessuna espressione di interneuroni spinali o assoni ascendenti o discendenti nella materia bianca è visto 4 , 5 , 6 , 7 . Complessivamente, questi dati mostrano che esiste una barriera biologico-anatomica altamente efficace, che impedisce la diffusione di AAV intrathecalmente erogato in un parenchima spinale più profondo.
In uno studio precedente che ha utilizzato ratti e suini adulti, è stata sviluppata una nuova tecnica di somministrazione del vettore subpiale 8 . Utilizzando questo approccio, è stata dimostrata un'espressione di transgene altamente potente e multi-segmentale dopo la somministrazione sub-AAV9 a singolo bolus. L'espressione intensa di GFP è stata osservata in modo coerenteNei neuroni, nelle cellule gliali e negli assi discendenti / ascendenti attraverso i segmenti spinali iniettati. Questo studio ha dimostrato per la prima volta che il pia mater rappresenta la barriera primaria che limita la diffusione efficace AAV9 nel parenchima spinale dallo spazio intrathecale. Mentre questa tecnica sviluppata in precedenza e il dispositivo di iniezione subpiale è relativamente facile da usare in grandi roditori (come ratti) o suini adulti, il sistema non è adatto per l'uso in piccoli animali, ad esempio adulti. A causa dell'elevato numero di modelli di topi transgenici disponibili di una varietà di disturbi neurodegenerativi, esiste una chiara necessità di sviluppare un'efficace tecnica di erogazione del vettore spinale-parenchimale nei topi. La disponibilità di tale tecnica permetterebbe lo studio dell'effetto di silenziamento specifico del gene ( ad esempio, utilizzando shRNA) o upregulation utilizzando cellule non specifiche ( ad es. Citomegalovirus-CMV o Ubiquitina) o cellule-specifiche ( ad es., Synapsin o glial Fibrillare acidoProteine (GFAP)) durante uno sviluppo postnatale precoce o in condizioni malate.
Di conseguenza, nel presente studio abbiamo sviluppato e convalidato un sistema di somministrazione subpiale in miniatura che può essere effettivamente utilizzato nei topi adulti. Allo stesso modo, come in precedenti studi su ratti e suini, questo lavoro dimostra un'espressione potente di transgene in tutto il parenchima spinale dopo la somministrazione subpiale AAV9 a singolo bolus nei topi. La semplicità di questo approccio, la buona tollerabilità dei topi iniettati alla consegna subpiale AAV9 e l'alta potenza dell'espressione di transgene nel parenchima spinale suggeriscono che questa tecnica può essere effettivamente implementata in qualsiasi ambiente di laboratorio e utilizzata in esperimenti che mirano all'espressione genica spinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio in corso descrive una tecnica di somministrazione subpiale (AAV9) in topi adulti. Come dimostrato nel video di accompagnamento, questo approccio e tecnica possono essere utilizzati in modo efficace, a condizione che gli strumenti necessari e l'ago a penetrazione del piombo e dell'iniettore subpiale siano correttamente fabbricati, secondo le specifiche stabilite e testate.
Variabili tecniche critiche nell'esecuzione di un'iniezione sottomessa consistente e si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione della Fondazione SANPORC e ALSA (Martin Marsala); Il Programma Nazionale di Sostenibilità, numero di progetto LO1609 (Ministero della Pubblica Istruzione, Gioventù e Sport); E RVO: 67985904 (Stefan Juhas e Jana Juhasova).
Materials
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50μl Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1000U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory | ||
References
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