Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor microinjection in de knaagdier hersenen die gebruikmaakt van kwarts naalden. Deze naalden niet produceren detecteerbare weefselschade en zorgen voor betrouwbare levering zelfs in diepe regio’s. Bovendien, zij kunnen worden aangepast aan de behoefte aan onderzoek door gepersonaliseerde designs en opnieuw kunnen worden gebruikt.
Abstract
Microinjections zijn gebruikt voor een lange tijd voor de levering van medicijnen of gifstoffen binnen specifieke hersengebieden en, meer recent, zij zijn gebruikt om gen of cel therapie producten te leveren. Helaas, de huidige microinjection technieken gebruik staal of glas naalden die suboptimaal om meerdere redenen zijn: met name stalen naalden weefselschade kunnen veroorzaken, en glas naalden kunnen buigen wanneer verlaagd diep in de hersenen, ontbreekt de doel-regio. In dit artikel beschrijven we een protocol voor te bereiden en gebruiken van kwarts naalden die een aantal handige functies combineren. Deze naalden produceren geen detecteerbare weefselschade en wordt zeer rigide, zorgen voor betrouwbare levering in de gewenste hersenen regio zelfs bij het gebruik van diepe coördinaten. Bovendien is het mogelijk het ontwerp van de naald iets persoonlijker maken door het maken van meerdere gaten van de gewenste diameter. Meerdere gaten vergemakkelijken de injectie van grote hoeveelheden van de oplossing binnen een groter gebied, overwegende dat grote gaten de injectie van cellen vergemakkelijken. Daarnaast kunnen deze quartz naalden worden gereinigd en hergebruikt, zodanig dat de procedure kosteneffectieve wordt.
Introduction
Microinjections zijn gebruikt voor een lange tijd voor de levering van farmacologisch werkzame stoffen te moduleren Neuronale activiteit in specifieke hersengebieden. Bovendien zijn ze gebruikt om het injecteren van giftige stoffen in de buurt van bepaalde neuronale populaties, na te bootsen neurodegeneratieve gebeurtenissen kenmerkend zijn voor bepaalde ziekten, bijvoorbeeld 6-hydroxy-dopamine in het nigrostriatal dopamine systeem om na te bootsen van Parkinson 1 , 2 – of de immunotoxin 192 IgG saporin aan laesie de cholinerge systeem3. Meer recentelijk, microinjection procedures zijn gebruikt om het leveren van virale vectoren of cellen protheses voor gen of cel therapie van experimentele hersenen stoornissen4,5.
Het klassieke soort naalden werkzaam in deze studies is gemaakt van roestvrij staal. Hoewel eenvoudig en praktisch in gebruik, stalen naalden hebben een aantal problemen6: ze zijn relatief groot en weefselbeschadiging, kan veroorzaken bij lekkage van de bloed – hersenbarrière en activering van astrocyten; Bovendien kunnen ze produceren boorkern van hersenweefsel dat in de naald creëren van obstakel of zelfs volledig vermijden van stroom van de gewenste oplossing brengt. Recenter, gebruik glas naalden bereid ad hoc van haarvaten bijgekomen in7,8. Deze veroorzaken geen significante weefsel schade noch Astrocyt activering, maar zijn betrekkelijk flexibel en kunnen buigen Wanneer geïntroduceerd in diepe structuren, vermindering van de nauwkeurigheid van lokalisatie (persoonlijke opmerkingen te maken).
Er is dus een noodzaak om zoveel mogelijk schade verminderen (met name bij het uitvoeren van experimenten om te genezen van schade) terwijl het verhogen van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid (dat wil zeggen, ervoor zorgen dat alle oplossing wordt geleverd en zorgen voor juiste lokalisatie). Bovendien zou het wenselijk zijn om verschillende naald ontwerpen gebruiken om de optimale verdeling van de geïnjecteerde oplossing in hersengebieden met uiteenlopende geometrieën. In dit artikel beschrijven we een protocol voor te bereiden en kwarts naalden gebruiken voor microinjections in de knaagdier hersenen. Als gevolg van het hoge smeltpunt, kwarts haarvaten kunnen niet worden getrokken op een conventionele trekker en daarom niet zijn gebruikt in het verleden voor het genereren van naalden. Kwarts, biedt echter een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van glas, in het bijzonder hoge stijfheid en breken weerstand9. Vanwege de stijfheid, kwarts naalden zijn bij uitstek geschikt voor injecties in de ventrale hersengebieden. Vanwege hun hoge weerstand tegen breuk kunnen zij worden gemodelleerd tot meerdere gaten, verkrijgen van ontwerpen die zelfs bij het uitstippelen van hersengebieden met complexe geometrieën10meest effectieve kunnen blijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De techniek die in dit artikel beschreven voldoet aan de behoeften die worden beschreven in de Introductie voor het optimaliseren van de microinjections die worden uitgevoerd voor verschillende doeleinden12. De hier beschreven naalden vermindering van de schade tot een minimum, in wezen niet-detecteerbare niveau; variantie met glas naalden (die gevoelig zijn voor buigen), kwarts naalden zijn rigide en zorgen voor een betrouwbare hit van de gewenste hersenen regio zelfs in diepe co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk heeft gesteund door een subsidie van de Europese Gemeenschap [KP7-mensen-2011-IAPP project 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
