Summary

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Published: June 23, 2017
doi:

Summary

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Abstract

La migración de neutrófilos y la quimiotaxis son fundamentales para el sistema inmunológico de nuestro cuerpo. Los dispositivos microfluídicos se utilizan cada vez más para investigar la migración de neutrófilos y la quimiotaxis debido a sus ventajas en visualización en tiempo real, control preciso de la generación de gradiente de concentración química y consumo reducido de reactivos y muestras. Recientemente, los investigadores microfluídicos han hecho un esfuerzo creciente para desarrollar sistemas de análisis de quimiotaxis microfluídicos integrados y fáciles de operar, directamente de sangre entera. En esta dirección, se desarrolló el primer método todo en chip para integrar la purificación negativa magnética de los neutrófilos y el ensayo de quimiotaxis a partir de muestras de pequeño volumen sanguíneo. Este nuevo método permite una rápida prueba de quimiotaxis de neutrófilos de muestra a resultado en 25 min. En este artículo, proporcionamos la construcción detallada, operación y método de análisis de datos para este ensayo de quimiotaxis todo en chip con una discusión sobre estrategias de solución de problemas, limiTaciones y direcciones futuras. Se muestran resultados representativos del ensayo de quimiotaxis de neutrófilos que prueban un quimioatrayente definido, N -formil-Met-Leu-Phe (fMLP) y esputo de un paciente con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), utilizando este método todo en chip. Este método es aplicable a muchas investigaciones relacionadas con la migración celular y aplicaciones clínicas.

Introduction

La quimiotaxis, un proceso de migración celular dirigida a un gradiente de concentración química soluble, está implicada de manera crítica en muchos procesos biológicos incluyendo la respuesta inmune 1 , 2 , 3 , el desarrollo de tejido 4 y la metástasis de cáncer 5 . Los neutrófilos son el subconjunto de glóbulos blancos más abundantes y desempeñan un papel crucial en la habilitación de las funciones innatas de defensa del huésped del cuerpo, así como en la mediación de las respuestas inmunes adaptativas 6 , 7 . Los neutrófilos están equipados con maquinaria quimiotáctica altamente regulada que permite a estas células inmunitarias móviles responder tanto a los quimioatrayentes derivados de patógenos ( por ejemplo, fMLP) como a los quimioatractores derivados del huésped ( por ejemplo, interleucina-8) a través de la quimiotaxis 8 . La migración de neutrófilos y la quimiotaxis median diversos problemas fisiológicosY enfermedades tales como inflamación y cánceres 1 , 9 . Por lo tanto, la evaluación precisa de la quimiotaxis de neutrófilos proporciona una lectura funcional importante para el estudio de la biología de neutrófilos y las enfermedades asociadas.

En comparación con los ensayos de quimiotaxis convencional ampliamente utilizados ( por ejemplo, el ensayo de transwell 10 ), los dispositivos microfluídicos son muy prometedores para la evaluación cuantitativa de la migración celular y la quimiotaxis debido a la generación de gradiente químico controlado con precisión y la miniaturización 11 , 12 , 13 . Durante las dos últimas décadas aproximadamente, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para estudiar la quimiotaxis de diferentes tipos de células biológicas, especialmente los neutrófilos 11 . Se realizó un esfuerzo significativo para caracterizar la migración de neutrófilos Micos que se configuraron en los dispositivos microfluídicos 14 , 15 . También se desarrollaron estrategias interesantes para estudiar la toma direccional de decisiones por parte de los neutrófilos utilizando los dispositivos microfluídicos. 16 Al margen de la investigación biológicamente orientada, las aplicaciones de los dispositivos microfluídicos se han ampliado para probar las muestras clínicas para la evaluación de la enfermedad 17,18,19. Sin embargo, el uso de muchos dispositivos microfluídicos se limita a laboratorios de investigación especializados y requiere un largo aislamiento de neutrófilos de un gran volumen de muestras de sangre. Por lo tanto, ha habido una tendencia creciente del desarrollo de dispositivos microfluídicos integrados para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre entera 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Hacia esta dirección, se desarrolló un método de todo en chip que integra la purificación de neutrófilos negativos magnéticos y el subsiguiente ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico 25 . Este método todo-en-chip tiene las siguientes características novedosas: 1) en contraste con las estrategias de chip anteriores que aíslan neutrófilos de la sangre mediante la captura de células basadas en adhesión o el filtrado basado en tamaño de celda 20 , 22 , Pureza, separación magnética sobre chip de los neutrófilos de pequeños volúmenes de sangre completa, así como medición de quimiotaxis mediante estimulación quimioatrayente; 2) la estructura de acoplamiento de células ayuda a alinear las posiciones iniciales de los neutrófilos cerca del canal de gradiente químico y permite un análisis de quimiotaxis simple sin rastreo de células individuales; 3) la integración del aislamiento de neutrófilos y chemotEje en un único dispositivo microfluídico permite un análisis rápido de la quimiotaxis de muestra a resultado en 25 minutos cuando no hay interrupción entre los pasos experimentales.

Este documento proporciona un protocolo detallado para la construcción, operación y análisis de datos método de este todo-en-chip quimiotaxis ensayo. El artículo demuestra el uso efectivo del método desarrollado para realizar la quimiotaxis de neutrófilos mediante la prueba de un quimioatrayente recombinante conocido y muestras quimiotácticas complejas de pacientes, seguido por una discusión sobre estrategias de resolución de problemas, limitaciones y direcciones futuras.

Protocol

Todos los protocolos de recolección de muestras humanas fueron aprobados por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de Manitoba, Winnipeg. 1. Fabricación de dispositivos microfluídicos ( Figura 1A ) Diseñe e imprima la máscara de la transparencia. Diseñar el dispositivo según lo detallado previamente 25 . Véase la figura 1A . NOTA: El disposi…

Representative Results

Los neutrófilos se seleccionan negativamente de una gota de sangre completa directamente en el dispositivo microfluídico. La pureza de los neutrófilos aislados se verificó por medio de chip Giemsa tinción y los resultados mostraron la forma de anillo en forma de anillo y lóbulo en forma de núcleos de neutrófilos ( Figura 2A ] [ 25] . Esto indica un aislamiento eficaz de neutrófilos en chip con alta pureza a partir de un peque…

Discussion

En este artículo, se describió un protocolo detallado para aislar directamente los neutrófilos de la sangre entera seguido de la prueba de quimiotaxis, todos en un único chip microfluídico. Este método ofrece características útiles en su fácil operación, selección negativa de neutrófilos de alta pureza, prueba rápida de quimiotaxis de muestra a resultado, reducción de reactivos y consumo de muestras y análisis preciso de datos de migración celular. Como una estimación aproximada, al menos el 25% de los …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es en parte apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (CRSNG) y los Institutos Canadienses de Investigación de Salud (CIHR). Damos las gracias al Instituto Clínico de Investigación Aplicada y Educación en el Hospital General Victoria en Winnipeg y Seven Oaks General Hospital en Winnipeg para la gestión de muestras clínicas de seres humanos. Damos las gracias al Dr. Hagit Peretz-Soroka para la discusión útil sobre las estrategias de la operación de ensayo. Agradecemos a la profesora Carolyn Ren y al doctor Xiaoming (Cody) Chen de la Universidad de Waterloo por su generoso apoyo en el proceso de filmación.

Materials

Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)
Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

References

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Cite This Article
Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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