In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à induire une tolérance à la transplantation et évaluer in vitro et in vivo la capacité suppressive des sous-ensembles distincts de cellules par le bénéficiaire et l’état immunitaire du receveur envers le donneur ou d’antigènes exogènes.
Abstract
La principale préoccupation dans la transplantation consiste à atteindre une tolérance spécifique par induction des cellules régulatrices. La compréhension des mécanismes de tolérance nécessite des modèles fiables. Nous décrivons ici des modèles de tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat, induite par le blocage des signaux de costimulation ou par stimulation de l’expression des molécules immunorégulatrices par transfert de gène. Chacun de ces modèles a permis d’en vivo génération de cellules régulatrices telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), cellules régulatrices de B (Bregs) ou des cellules myéloïdes réglementaires (RegMCs). Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent deux protocoles complémentaires qui ont été utilisés pour identifier et définir l’activité de régulation cellulaire in vitro et in vivo pour déterminer leur responsabilité dans l’induction de la tolérance et le maintien. Tout d’abord, un essai in vitro suppressive avec ont permis l’identification rapide des cellules avec capacité suppressive de réponses immunes effectrices dans une façon dose-dépendante et peut être utilisé pour une analyse ultérieure comme mesure de cytokine ou la cytotoxicité. En second lieu, le transfert adoptif de cellules d’un bénéficiaire traité tolérant à un destinataire greffé récemment irradié, a mis en évidence les propriétés tolérogène de ces cellules dans le contrôle des réponses immunitaires greffon réalisé et/ou conversion de (nouveaux) cellules régulatrices qualifié de tolérance infectieuse). Ces méthodes ne se limitent pas aux cellules avec des marqueurs phénotypiques connus et peuvent être étendues à toute la population cellulaire. De plus, donateur a ordonné allospecificity des cellules régulatrices (un objectif important dans le domaine) peut être évaluée à l’aide de cellules du donneur tiers ou greffer soit in vitro ou in vivo. Enfin, pour déterminer la capacité tolérogène spécifique de ces cellules régulatrices, nous fournissons des protocoles visant à évaluer les réponses humorales anticorps anti-donateurs et la capacité du bénéficiaire à élaborer des réponses humorales contre des antigènes connus neufs ou anciens. Les modèles de tolérance décrite peuvent être utilisés pour caractériser les cellules régulatrices, afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs et immunorégulatrices molécules et peuvent être adaptés à d’autres modèles de transplantation ou de maladies auto-immunes chez rongeur ou humaine.
Introduction
Allogreffe cardiaque chez le rat est un modèle de greffe organe fiable pour évaluer les traitements d’induction de la tolérance, pour décrypter les mécanismes d’induction de la tolérance et de la maintenance et est susceptible d’induire des cellules régulatrices fonctionnellement compétents et dominantes. Les protocoles ci-dessous décrivent une entièrement incompatibilité transplantation cardiaque greffe d’un rat de donneur de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en rat destinataire 1 a Lewis (LEW.1A, RT1un). Dans cette combinaison de greffe, le rejet aigu se produit rapidement (dans environ 7 jours) et peut être facilement évaluée par greffon battant mesure par palpation de l’abdomen. Ici, nous vous proposons trois protocoles pour induire une tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat. Dans ces modèles, tolérance est induite et/ou maintenue par types de différentes cellules réglementaires. Tout d’abord, le blocage des interactions CD40-CD40L avec un adénovirus encodage CD40Ig (AdCD40Ig) induit par la génération de CD8+ Tregs capables d’induire la tolérance lorsque Moutschen transféré à destinataires greffées1. En outre, l’appauvrissement des CD8+ cellules (avec des anticorps anti-CD8α) destinataires traités AdCD40Ig générés Bregs et RegMCs2. Une analyse approfondie des CD8+ Tregs propriétés a mis en évidence le rôle essentiel de plusieurs molécules immunorégulatrices défini comme interleukin-34 (IL-34) et Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Tandis que la surexpression de IL-34 (avec un vecteur d’AAV) induite Tregs grâce à la génération de RegMCs, la surexpression de la FGL-2 induit Bregs, qui sous-tend le réseau complexe de cellules régulatrices.
Parce que le rejet chronique se développe lentement et est à long terme, une analyse approfondie est nécessaire pour distinguer la tolérance par rapport à un rejet chronique. Greffon est habituellement évaluée pour l’infiltration cellulaire, fibrose, épaississement des dépôts C4d vasculaire à mur et complément par immunohistologie7. Alors que l’histologie méthodes exigent des sacrifices d’animaux ou de greffe biopsie, nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer les différentes caractéristiques des greffes allogéniques tolérés : l’émergence et la fonction des cellules régulatrices et les réponses d’anticorps spécifiques anti-donneur de sang échantillon par cytométrie en flux (ici, nous avons utilisé cellule activée par fluorescence (FACS) de tri).
Maintien de la tolérance à l’allogreffe après arrêt du traitement est généralement associée à l’induction de cellules régulatrices8. Au cours des dernières décennies, les études concentrent CD4+Tregs caractérisée à l’unanimité eux par les marqueurs clés Foxp3+, CD25hauteet CD127–9,10,11. De même, plusieurs marqueurs ont été attribuées aux CD8+ Tregs, comme CD122+et CD28–, CD45RCfaible, PD1+et Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. pendant les années, l’expression de GITR CTLA4 et cytokines (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, GFL-2) ont été en outre associée à un Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Cependant, les populations de lymphocytes régulateurs émergents, tels que Bregs, RegMCs ou NKTregs, n’ont pas des marqueurs spécifiques pertinentes. En effet, les Bregs sont surtout signalés comme immatures CD24+ cellules, avec expression CD27 ambiguë et, parfois, la production d’IL-10, TGFβ ou granzyme B22,23,24. La complexité de la lignée cellulaire myéloïde exige une combinaison de plusieurs marqueurs de définir leur profil réglementaire ou proinflammatoires comme CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Enfin, certains marqueurs ont été signalés à identifier NKTregs comme CD11b+, CD27+, TGFβ+, mais autres études sont nécessaires pour plus loin phénotypiquement Décrivez-les27,28,29 ,30,31,32. Ainsi, les preuves d’activité suppressive sont tenus de légitimer davantage description phénotypique pour l’identification de nouveaux biomarqueurs, nouveau immunorégulatrices médiateurs et d’étendre la portée aux nouvelles thérapies cellulaires.
Nous vous proposons deux méthodes complémentaires afin d’évaluer l’activité suppressive des cellules. Tout d’abord, la méthode in vitro consistant en cultivant des cellules suppressives avec des cellules effectrices marqués T stimulés par les donneurs allogéniques cellules présentatrices (TTB) à différentes proportions pendant 6 jours, et analyser l’effecteur T la prolifération de cellules qui reflète l’immunodépression axée sur les donateurs. Cellules provenant de rats traités peuvent être comparés directement aux cellules de rats naïfs et non greffées chez les rats traités pour activité suppressive (ou à toute autre population de lymphocytes régulateurs), dans une gamme de rapports de suppresseur : effecteur. En outre, cette méthode ne requiert pas une transplantation, et on obtient des résultats dans les 6 jours. Deuxièmement, la méthode in vivo consiste à transférer les cellules réglementaires prévues d’un rat traité à un destinataire greffé récemment irradié. Bien que les cellules B des cellules, cellules myéloïdes ou T de rats naïfs non traités sont généralement incapables d’inhiber le rejet aigu et pour prolonger la survie du greffon à transfert adoptif, cellules avec activité suppressive potentialisée des traités-bénéficiaires ont ces attributs 1,2,3,4,33. Lymphopénie induite par l’irradiation du destinataire est recommandée de laisser des cellules Moutschen transférés sont pas affectés par l’homéostasie du sang et de maîtriser plus facilement la réponse immunitaire anti-donateur. Pour les deux méthodes, l’utilisation in vitro d’allogéniques tiers TTB ou en vivo transfert adoptif de suppressive cellules destinataires greffés avec un coeur de tiers permettent l’analyse de la spécificité anti-donateur. Considérant que la méthode en vivo nécessite un nombre important de cellules, mal représenté sous-populations de cellules peuvent être évaluées plus facilement pour l’activité suppressive en vitro33.
Humorale peut également être mesurée afin d’évaluer l’état de la tolérance et le contrôle de la production d’anticorps dirigés aux antigènes du donneur. En effet, la tolérance peut être caractérisée par l’absence de réponse humorale envers le donateur mais la conservation de la capacité pour les destinataires à développer une réponse humorale aux antigènes nouveaux et la préservation des réponses de la mémoire. Tout d’abord, le principe de la détection des alloanticorps repose sur la reconnaissance des cellules donneur par destinataires anticorps après incubation du type de cellules du donneur avec le sérum d’un bénéficiaire greffé. Deuxièmement, humorales réponses adressées à des antigènes exogènes peuvent être mises en recouvrement après la stimulation des receveurs tolérants à long terme avec Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) émulsionné avec adjuvant complet de Freund. La présence d’anticorps IgM et IgG spécifiques contre les antigènes peut être détectée 4 à 13 jours, respectivement, après vaccination, par l’Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. En troisième lieu, la préservation des réponses de la mémoire immunitaire peut être évaluée par l’injection de xénogéniques des globules rouges (hématies) -7 et + 3 jours de transplantation et de globules rouges de coloration avec le destinataire sérum prélevé à jours + 8 et + 17 suite à une transplantation. Toutes ces méthodes permettent l’identification des sous-types de l’immunoglobuline en utilisant des anticorps secondaires spécifiques et l’acquisition rapide des résultats en moins de 1,5 h par coloration de FACS ou quelques heures par ELISA.
Enfin, ces protocoles sont conçues pour la caractérisation des modèles de transplantation et peuvent être, dans une certaine mesure, appliquée aux modèles de maladie auto-immune. Les principes de la méthode est transposable à toutes les espèces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfert adoptif de splénocytes totales dans un receveur nouvellement greffé est un moyen efficace pour détecter la présence de cellules régulatrices induites ou potentialisée par un traitement. Hôte induite par l’irradiation transitoire lymphopénie favorise la survie des cellules après le transfert et la mise en place de la tolérance. En outre, irradiation sublétale laisse de temps pour les cellules avec propriétés tolérogène pour convertir les nouvelles cellules réglementaires au cours de la reconsti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) qui fait partie du programme « Investissements d’avenir » Gouvernement Français géré par l’ANR (ANR-11-LABX-0016-01) et le projet IHU-Cesti, financé également par la » Investissements d’avenir » programme de gouvernement Français, géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire.
Materials
| animals | |||
| LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| name | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
| RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
| Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
| Complete Freund's adjuvant | |||
| Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
| Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
| complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
| name | company | catalog number | comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| sieve | |||
| Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
| 100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
| 96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
| 96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
| seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
| centrifuge | |||
| bain marie | |||
| X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| solar agitator | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |
References
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