Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti – Pilz – Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell – Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilz Erreger invasive Infektionen bei immunsupprimierten Patienten mit einer hohen Letalität. Forschung untersucht immunologische Reaktionen gegen A. fumigatus wird durch den Mangel an einheitlichen und zuverlässigen Tests zur Messung der Anti – Pilz – Aktivität von Immunzellen in vitro beschränkt. Ein neues Verfahren wird beschrieben , um die antimykotische Aktivität von primären Monozyten und Neutrophilen von menschlichen Spendern gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Conidien zu beurteilen. Diese Konidien enthalten eine genetisch dsRed Reportergen codiert wird , die konstitutiv von lebenden FLARE Konidien exprimiert wird, und extern mit Alexa Fluor 633 markiert ist, die zu einer Verschlechterung im Phagolysosom resistent ist, so dass eine Unterscheidung zwischen lebenden und toten A. fumigatus Konidien ermöglicht. Video-Mikroskopie und Zytometrie werden fließen anschließend verwendet, um die interact zu visualisierenion zwischen Konidien und angeborenen Immunzellen, der Beurteilung fungizide Aktivität, während auch eine Fülle von Informationen über Phagozyten Migration, Phagozytose und die Hemmung des Pilzwachstums bereitstellt. Diese neue Technik hat bereits spannende neue Einblicke in die Wirt-Pathogen – Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zur Verfügung gestellt. Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, die notwendige Mikroskopie einschließlich und Durchflusszytometrie-Einrichtungen und die Fähigkeit, mit menschlichem Spenderblut zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilzen. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen – Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren.
Es ist wichtig, den Laboraufbau beachten erforderlich, um diesen Test durchzuführen, einschließlich der notwendigen Mikroskopie und Durchflusszytometrie finrichtungen, und die Fähigkeit, die menschlichen Spenderblutes zu arbeiten und genetisch manipulierten Pilze. Dieser Test ist jedoch in der Lage, große Datenmengen zu erzeugen und detaillierte Einblicke in die antimykotische Reaktion offenbart. Dieses Protokoll wird erfolgreich verwendet worden , um die Wirt-Pathogen – Interaktion von primären Immunzellen gegen A. fumigatus zu studieren.
Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Pilzpathogens und die häufigste Pilz Ursache für invasive Lungeninfektionen bei immungeschwächten Wirt 1, 2. Zu verstehen , wie Host – Immunzellen erkennen und beseitigen Aspergillus ein wichtiger Bereich der Pilzforschung hat jedoch das derzeit verfügbare fungizide Assays erhebliche Einschränkungen. Colorimetrischen Assays und die Bestimmung der koloniebildenden Einheiten 3, 4 üblicherweise verwendete Methoden umfassen fungizide Aktivität zu messen. Allerdings bieten solche Methoden Informationen über Pilz-Lebensfähigkeit an einem einzigen Zeitpunkt, anstatt die dynamische Interaktion zwischen Wirt und Pathogen sehen. Dementsprechend können diese Verfahren nicht berücksichtigt, ob ein Pilz getötet wurde oder einfach (vorübergehend) beschränkt in Wachstum oder metabolische Aktivität. Wir haben ein Verfahren in der Lage zu beobachten fungici entwickeltdal-Aktivität direkt und gleichzeitig detaillierte Informationen in Bezug auf die Phagozytose, Phagozyten Migration und Hemmung des Pilzwachstums zu erfassen.
Zuvor wurde ein Protokoll Echtzeit – Bildgebung als Mittel unter Verwendung veröffentlichten 5 Phagozytose von Candida albicans durch eine Maus – Makrophagen – Zelllinie zu messen. Dieses Konzept wurde nun weiterentwickelt , die Wissenslücke in unserem Verständnis von Aspergillus Interaktionen mit Immunzellen zu adressieren , indem fluoreszierenden Aspergillus reporter (FLARE) Konidien 6, 7, 8 verwendet. Diese Konidien exprimieren einen roten Fluorophor (dsRed) und mit einem zweiten Fluorophor (Alexa Fluor 633) markiert. Sobald ein FLARE Konidie getötet wird, stoppt es produziert dsRed und die restlichen dsRed schwindet, während die AF633 an die Konidien Leuchtstoff- und gebunden bleibt. Dadurch entsteht eine klare Unterscheidung zwischen lebenden und toten fungal Zellen während der Live Cell Imaging und Durchflusszytometrie und ermöglicht Verfolgung des Schicksals der einzelnen Konidien nach ihrer Wechselwirkung mit Immunzellen.
Die beschriebenen Assays stellen ein effektives Verfahren der Interaktion zwischen Wirt und Immunzellen Aspergillus Visualisierung und wird in entwirren die zelluläre Signalwege , die für antimykotische Effektormechanismen in angeborenen Immunzellen von beträchtlichem Wert sein. Andere Anwendungen umfassen die Visualisierung , wie Veränderungen in Aspergillus Wachstum, wie zum Beispiel der Umstellung von geschwollenen Konidien ruhen oder von geschwollenen Konidien zu Hyphen, Phagozyten Anerkennung und Funktion beeinflussen.
Das folgende Protokoll beschreibt detailliert, wie menschliche Monozyten und Neutrophilen zu erhalten; wie die FLARE Konidien vorzubereiten; und wie ihre Antworten mit Videomikroskopie zu erfassen und Durchflusszytometrie. Obwohl die Verwendung von menschlichen Immun aus Spenderblut isolierten Zellen wird hier beschrieben, dieseTechnik hat sich ebenso bewährt eine Vielzahl von Maus-Zellpopulationen verwendet wird.
Diese Methode beschreibt ein innovatives Verfahren in vitro die antimykotische Aktivität von humanen primären Phagozyten gegen A. fumigatus unter Verwendung fluoreszierender Aspergillus REPORTER (FLARE) Konidien, lebender Zellen und Durchflusszytometrie zu studieren. Frühere Studien haben den zusätzlichen Nutzen der Verwendung von FLARE Konidien sowohl in vivo in murine experimentelle Pilzinfektion und in vitro – Bewertung der antifungalen Immunität 6, 7 gezeigt. FLARE Konidien mit dieser nächsten Generation lebenden Zellen Bildgebungstechnik der Kombination ermöglicht ein Setup – Lebensfähigkeit einzelner Konidien während der dynamischen Interaktionen in vitro zu messen.
Das beschriebene Verfahren hat das Potential, die spezifischen Aufgaben und Bedeutung bestimmter zellulärer Prozesse der Immunzellen auf ihren Anti-Pilz-Reaktionen zu untersuchen. Darüber hinaus Anti-Pilz-Antworten von Phagozyten von bestimmten Patienten, die andefiniert einzelne Komponentenfehler in ihrem Immunsystem genauer beurteilt werden. Schon sehr früh und erste Anti-Pilz-Antworten können sehr detailliert über 6 h der kontinuierlichen Bildgebung untersucht werden. Dies ermöglicht auch feine Unterschiede 12 erfasst wird , wie beispielsweise die Geschwindigkeit von Phagozyten Migration in Richtung des Pilzes, Internalisierung Raten, Dynamik von fungiziden Ereignisse werden, die ununterscheidbar mit Verfahren herkömmlicher Phagozytose wäre.
Jeder Zelltyp kann mit diesem Verfahren verwendet werden; die Zelltypen hier verwendet wurden ausgewählt , weil diese Phagozyten die erste und die zweite Linie der Verteidigung in den menschlichen Atemwege gegen A. fumigatus 13 bilden. Interessanterweise sehr deutliche Unterschiede zwischen, wie Monozyten und Neutrophilen Eingriff mit Rast- und geschwollen Konidien und Hyphen beobachtet werden. Monozyten wandern kaum zu Konidien, während Neutrophilen viel mehr wandernde Aktivität. Zusätzliche Fluoreszenz markers wie auf Immunzellen Live-dead – Marker können in dem Test aufgenommen werden Einblicke in die Phagozyten Überleben mit Aspergillus folgenden Wechselwirkungen zu liefern. Interessante mögliche zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind die Co-Kultur von verschiedenen Wirtszelltypen, die Folgen für die Anti – Pilz – Reaktionen (zB Makrophagen auf einer epithelialen einschichtige, Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen zusammen mit neutrophilen Granulozyten) und der Echtzeit – Messung von reaktiven Sauerstoffspezies Produktion oder neutrophil extrazellulärem trap Bildung mit Aspergillus nach Stimulation.
Einige Punkte sind zu beachten, um dieses Protokoll zu verwenden, in erster Linie den Laboraufbau benötigt: ein Mikroskop mit einer invertierten Phase, eine Klimakammer stabil bei 37 ° C, und den Anregungs- / Emissionsfilter für dsRed (532/561 nm) und AF633 ( 633 nm). Die Fähigkeit des Mikroskops der Zellen im Fokus zu halten und das Eintauchen in Öl (besonders relevant bei m behaltenulti Punkterfassung) sollte in regelmäßigen Abständen aufgrund der langen Dauer der Bildgebung überwacht werden. Zur Quantifizierung der fungiziden Wirkung Durchflusszytometrie Einrichtungen erforderlich sind. Außerdem müssen geeignete institutionelle und ethische Genehmigungen vorhanden sein, mit gesunden Spendern und Patienten abgeleitet Blutproben und genetisch manipulierten Pilzen zu arbeiten. Es wird dringend die Verwendung frischer Blutproben (Verwendung am selben Tag) zu erhöhen, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Erhaltung Funktionalität empfohlen. Im Idealfall ist die Isolierung von Zellen durchgeführt, unmittelbar nachdem die Blutproben Zeichnung und Neutrophile werden unmittelbar nach der Isolierung abgebildet.
Abschließend wird eine nächste Generation Lebendzellabbildungstechnik in großer Detail Phagozyten antimykotische Aktivität zu beurteilen , gegen A. fumigatus beschrieben. Diese Technologie kann einen einzigartigen Einblick in einzelne Zell-Pilz-Interaktionen in der frühen angeborenen Immunabwehr gegen Aspergillus bereitzustellen.
The authors have nothing to disclose.
Medizinische Mykologie Pilz Immunologie (SFB, JMB, JK, AW) – Diese Arbeit wurde von der MRC und die University of Aberdeen (MRC Zentrum für Medizinische Mykologie) und vom Wellcome Trust Strategic Auszeichnung unterstützt. Ein ganz besonderer Dank an die Unterstützung der Chloe Fonds gegeben. TMH wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Health (NIH, Code RO1 093.808) und das Memorial Sloan Kettering Cancer Center wird unterstützt von NIH Zuschuss P30 CA008748 unterstützt. Darüber hinaus ist TMH ein Ermittler in der Pathogenese von Infektionskrankheiten durch den Fond Burroughs Wellcome unterstützt. Wir wünschen der Aberdeen Mikroskopie und Histologie Einrichtung für ihre Hilfe und Unterstützung danken.
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CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
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µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
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BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |