Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü
Summary
Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.
Abstract
kas lifi popülasyonlarının miktarının belirlenmesi hastalık, travma ve iskelet kas bileşimine çeşitli diğer etkilerden daha derin bir fikir verir. Çeşitli zaman alıcı yöntemler geleneksel olarak araştırmanın pek çok alanında fiber popülasyonları incelemek için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda tek bir bölümünde birden çok elyaf tiplerini belirlemek için pratik bir alternatif temin miyozin ağır zincir protein ifadesine dayalı immünohistokimyasal yöntemleri geliştirilmiştir. Burada, bütün kesit ve ImageJ fiber popülasyonlarının otomatik ölçümü otomatik olarak alınmasının sağlayan, geliştirilmiş boyama kalitesi için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Bu amaç için, gömülü iskelet kasları hücrelerinin çekirdekleri boyama ikincil floresan antikor ve DAPI ile miyozin ağır zincir antikorlar kullanılarak boyanmış, kesitler kesilir. Tüm çapraz Kesitler daha sonra yüksek çözünürlüklü bir kompozit elde etmek için bir kayar tarayıcı kullanarak otomatik olarak taranırtüm örneğin resimler. Lif nüfus analizleri sonradan ImageJ için otomatik bir makro kullanarak, yavaş, orta ve hızlı lifleri ölçmek için yapılır. Daha önce bu yöntem ±% 4 bir dereceye kadar güvenli bir elyaf popülasyonlarının belirlenmesi göstermiştir. Buna ek olarak, bu yöntem arası kullanıcı değişkenliği ve önemli ölçüde açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak analiz başına süresini azaltır.
Introduction
İskelet kası bileşim, yaşlanma, 1, 2, egzersiz, 3, 4, 5, 6, 7 ya da böyle bir hastalık 8, 9, 10 ya da travma 11 olarak patofizyolojik işlemler gibi fizyolojik süreçlerde önemli değişikliklere uğrar. Dolayısıyla, bu süreçlerin yapısal etkileri konusunda araştırma konsantresi birkaç alanları işlevsel değişiklikleri anlamak için. kas fonksiyonunu belirleyen önemli yönlerinden biri kas liflerinin bileşimdir. Kas lifleri, farklı miyozin ağır zincir (MHC) proteinleri ifade eden ve bu şekilde, 13 yavaş, orta ya da hızlı lifler 7, 12 sınıflandırılır </sup >, 14, 15, 16, 17. Fizyolojik olarak, kaslar vücutta işlev bağlı olarak farklı kas lifi bileşimleri vardır. Kas lifi yazmaya kullanılarak, lif popülasyonları, 17, fizyolojik veya patofizyolojik süreçler 7 uyarlanmasına belirlemek için ölçülebilir. Tarihsel olarak, zaman alıcı bir dizi yöntem kas lifi tipleri arasında ayırt etmek için uygulanmıştır. Bu amaç için, kas lifleri çeşitli pH seviyelerinde veya kas enzim aktivitesinin de myosin ATPase reaktifliğinden olarak sınıflandırıldı. Farklı lif kalitesi tek bir bölümü tespit edilemedi, birden çok enine kesitleri, tüm kas lifleri tespit ve miktar 14, 16, 17 kılavuzu izin vermek için gerekli olduğunu,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. Buna karşılık, yeni yayınlar hızla tek kesitlerinde çok liflerini boyamak için miyozin ağır zincir proteine karşı immünohistokimya (IHC) kullanılabilir. Bu prosedürün avantajları dayanarak, şimdi kas lifi nüfus analizi 19, 23, 24 altın standart olarak kabul edilir. geliştirilmiş IHC boyama protokolleri kullanarak, tüm kas kesitleri ve daha sonra otomatik bir kas lifi miktar tam otomatik satın açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak uygulanabilir olduğunu göstermek için yakın zamanda mümkün. Kılavuzu ölçümü ile karşılaştırıldığında, prosedür 4 ±% olurken slayt başına gereken süre (kılavuzun yaklaşık% 10 analizleri) önemli bir azalma sağlanmaktadır 25 </s> Yukarı.
Bu yöntemin genel amacı, bir açık kaynak platformu kullanılarak bütün sıçan kaslarda otomatik kas lifi ölçümü için hızlı, güvenilir ve kullanıcıdan bağımsız kılavuzunun tanımlamaktır. Buna ek olarak, özellikle fareler veya insan kas gibi diğer numuneler için kullanılmalarını sağlayan potansiyel değişiklikleri tarif eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, çalışma ve otomatik olarak bir zaman etkili bir şekilde immünohistokimya ile sıçan kesitlerinin kas lifi popülasyonları ölçmek için yaygın olarak erişilebilir bir yöntem göstermektedir. tekrarlanabilirlik için, adım açıklama ve bu çalışmada açıklanmayan diğer türlerde uygulamalar için potansiyel modifikasyonlarla detaylı adım sunuyoruz. Ayrıca, en iyi işlev ve sınırlamaları için prosedürün avantajları, ön koşulları tartışır.
Şu anda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Christian Doppler Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Proje boyunca destek için Viyana, Avusturya Tıp Üniversitesinde Çekirdek Tesisi Görüntüleme Sabine Rauscher teşekkür etmek istiyorum. İlköğretim antikorlar NIH NICHD yarattığı ve Iowa, Biyoloji Bölümü, Iowa City Üniversitesi'nde muhafaza Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde, Schiaffino, S. tarafından geliştirilmiştir.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
