L'incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging
Summary
Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 – 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per> 24 h.
Abstract
Acuta preparati tessuto neuronale, fettine di cervello e della retina wholemount, di solito può essere mantenuta solo per 6-8 ore dopo la dissezione. Ciò limita il tempo sperimentale, e aumenta il numero di animali che sono utilizzate per studio. Questa limitazione in particolare gli impatti protocolli come l'imaging di calcio che richiedono una prolungata pre-incubazione con coloranti vasca da applicare. crescita batterica esponenziale entro 3 – 4 h dopo il taglio è strettamente correlata con una diminuzione della salute dei tessuti. Questo studio descrive un metodo per limitare la proliferazione di batteri preparati acute per mantenere il tessuto neuronale vitale per periodi prolungati di tempo (> 24 h) senza la necessità di antibiotici, procedure sterili o terreni di coltura contenenti fattori di crescita. Con ciclismo liquido extracellulare tramite irradiazione UV e mantenendo il tessuto in una camera di contenimento personalizzati 15 – 16 ° C, il tessuto non mostra differenze nelle proprietà elettrofisiologiche, o si calciognaling attraverso coloranti intracellulari di calcio a> 24 h postdissection. Questi metodi non solo estendere il tempo di sperimentazione per coloro che utilizzano il tessuto neuronale acuta, ma ridurrà il numero di animali necessari per completare gli obiettivi sperimentali, e stabiliscono un gold standard per l'incubazione del tessuto neuronale acuta.
Introduction
Elettrofisiologia e di imaging funzionale (calcio, tensione di coloranti sensibili) sono due delle tecniche sperimentali più comunemente utilizzati nel campo delle neuroscienze. preparati fetta del cervello e della retina wholemount, che sarà esaminato qui, forniscono un mezzo per esaminare le proprietà elettrofisiologiche e connettività sinaptica senza contaminazione da anestetici o miorilassanti. Fettine di cervello e della retina wholemount mantenere la loro integrità strutturale, a differenza di culture o omogenati cellulari, permettendo lo studio di circuiti specifici e reti del cervello 1. Le registrazioni dal tessuto isolato presentano vantaggi rispetto vivo registrazioni i movimenti connessi con il battito cardiaco e la respirazione sono eliminati. Inoltre, la visualizzazione diretta permette specifiche classi di celle da mirati, e l'applicazione locale di strumenti farmacologici 2, 3.
registrazioni patch-clamp e calcIUM Dye-carico in wholemount retina è complicato dalla presenza di Inner Limitazione membrana (ILM), che copre lo strato di cellule gangliari della retina (RGC) e impedisce l'accesso diretto alle cellule. Tipicamente, questa membrana è raschiato via con una pipetta di vetro per consentire l'applicazione diretta di una pipetta di patch e la formazione di un sigillo gigaohm su una singola cella. Inoltre, coloranti calcio bagno-applicata non attraversano la ILM e devono o essere iniettato sotto questa membrana 4, retrograda trasportato dopo l'iniezione al nervo ottico o 5 elettroporate attraverso il tessuto 6. Inoltre, quando si utilizza un modello di roditore di retinite pigmentosa, il mouse rd / rd, la ILM è più spessa e più impenetrabile. Qui, si usa una tecnica per rimuovere il ILM con digestione enzimatica 7, per consentire sia onnipresente calcio dye-carico e l'accesso diretto alle cellule gangliari della retina per recordi patch-clampngs 8.
registrazioni di successo da entrambi fettine di cervello o wholemount retina dipendono da dissezione e l'incubazione del tessuto neuronale vitali. Tipicamente, il tessuto viene estratto il mattino dell'esperimento ed incubato nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) fino al suo utilizzo per le registrazioni. Di solito, il tessuto rimane vitale per 6 – 8 ore, con notevole degrado in seguito questa finestra temporale. Tuttavia, entrambe le fettine di cervello e preparati RETINÆ wholemount solito producono più tessuto che può essere registrata all'interno di questo breve periodo di tempo. Di conseguenza, il tessuto è spesso scartata alla fine della giornata e la dissezione è completata nuovamente nei giorni successivi. Questo significa che un altro animale è utilizzato e ~ 2 ore di messa a punto e la dissezione / colorazione ripetuto. Il protocollo che segue descrive un metodo per prolungare la durata del tessuto neuronale per più di 24 ore, il che significa meno animali vengono utilizzati, e il tempo più sperimentale è disponibile. Tissue vitalità wvalutata attraverso la registrazione di proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio, e queste proprietà erano indistinguibili tra <4 ore e> 24 ore postdissection.
Questi risultati indicano che non solo sono proprietà delle celle singole intatte e funzionali dopo incubazione prolungata, ma l'attività di rete, come valutato dal calcio-imaging e registrazioni elettrofisiologiche, è invariato> 24 h postdissection. Inoltre, dimostriamo che coloranti calcio possono rimanere nelle cellule per periodi prolungati senza provocare effetti dannosi. L'applicazione di questo protocollo dimostra che l'attività funzionale dei neuroni nel tessuto neuronale acuta può essere mantenuta per lunghi periodi, una volta che l'ambiente esterno è altamente regolata. Inoltre, come la vitalità del tessuto varia notevolmente tra i laboratori a causa di diversi protocolli di incubazione, questo metodo stabilisce un gold standard per i parametri ideali che dovrebbero essere applicati per ridurre la variabilità nella salute di Neu acutatessuto Ronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un metodo di incubazione per estendere la vitalità del tessuto neuronale acuta per immagini ed elettrofisiologici esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per completare obiettivi sperimentali. Due processi principali governano il deterioramento del tessuto neuronale nel tempo: i) un aumento dei livelli di batteri, e il conseguente aumento endotossina batterica rilasciato, e ii) eccitotossicità che segue la procedura affettamento traumatica 10. Come t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
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