Summary

Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Published: April 13, 2017
doi:

Summary

Здесь мы приводим протокол , чтобы изолировать микроглии от послеродовых щенков мышей (день 1) для экспериментов в пробирке. Этот импровизированный способ выделения генерирует и высокий выход и чистоту, значительное преимущество по сравнению с альтернативными методами, что позволяет широкий диапазон экспериментов для целей выяснения микроглии биологии.

Abstract

Микроглия являются основными ответчиками к центральной системе нервных инсультам; Однако, многое остается неизвестным об их роли в регулировании нейровоспаления. Микроглия являются мезодермальными клетками, которые функционируют так же, как в макрофаги съемки воспалительного стресса. активаций макрофагов классической (М1-тип) и альтернативный (М2-типа) также были распространены на микроглии в попытке лучше понять основные взаимодействие эти фенотипы имеют в нейровоспалительных условиях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и Хантингтона. В пробирке экспериментов с использованием первичной микроглии предлагает быстрые и надежные результаты , которые могут быть распространены на окружающую среду в естественных условиях. Хотя это является явное преимущество по сравнению с экспериментированием в естественных условиях, выделение микроглии при достижении достаточных урожаев оптимальной чистоты была проблемой. Общие методы в настоящее время используются либо страдают от низкого извлечения, низкой чистоты, или обоих. При этом, мы демonstrate уточнения в CD11b метода магнитной сепарации без колонн, что обеспечивает высокое восстановление клеток и повышенную чистоту в половине количества времени. Мы предлагаем этот оптимизированный метод как весьма полезную модель первичной микроглии изоляции для целей изучения нейровоспаления и нейродегенерации.

Introduction

Микроглия являются Myb-независимые макрофаги резидентов мезодермального происхождения, отличающие от с-Kit + / CD45- erythromyeloid клеток – предшественников в крови островках желточного мешок 1, 2. После того, как эмбриологические микроглии колонизировали на центральную нервную систему (ЦНС), они переходят из амебоидных к разветвленной форме 3. Эти взрослые микроглии классифицируются как Surveillant , поскольку их динамические последствия зондировать здоровую паренхиму мозга для потенциальных оскорблений 4. Хотя микроглии только способствуют примерно 10% населения ЦНС клеток, их способность плитки между собой обеспечивает максимальное сканирование паренхимы 4, 5. Опасность-ассоциированные молекулярные структуры (DAMPS), такие как альфа-синуклеин 6, 7 и амилоид-бета, 8 или рathogen-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs) , такие как липополисахариды (LPS) 9, классически активации микроглии для содействия воспалительного ответа , характеризующийся реверсии в активное состояние амебоидной и производство оксида азота, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО), интерлейкин 1 & beta ; (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, и хемокинов CC мотив лиганда 2 9, 10, 11. В нейровоспалительных условиях , таких как болезнь Паркинсона, в котором патогенные α-синуклеина накопил, нейродегенеративного цикл создается из смерти дофаминергических нейронов, которые высвобождают более агрегированный альфа-синуклеина, дальнейшее продвижение классической активации микроглии 7. Подобно периферических макрофагах, микроглии может также иметь возможность альтернативно активировать в присутствии анти-воспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, что дает им сильнодействующимIAL продвижения нейронную ремонта и ослабления воспаления 2, 11. Помимо своих иммунологических ролей в ЦНС, микроглии были описаны как жизненно важные регуляторы нейронной цепи, сокращая синапсов в процессе разработки. Так , например, у мышей KO Cx3cr1- имеет менее плотные микроглии и снижение синаптической обрезку, что приводит к переизбытку дендритных шипов, незрелых синапсов и электрофизиологических моделей неразвитого ЦНСА 12. Понимание этих физиологических сложностей и разнообразные функциональные роли микроглии в гомеостазе ЦНС имеет решающее значение для поиска терапевтических средств, ориентированных на нейродегенеративных расстройств.

В области нейроиммунологии, в пробирке эксперименты весьма желательны из – за большей возможности для механистических исследований, более низкие затраты на техническое обслуживание, а также за то , что меньше времени и трудоемким. Furthermoповторно, способность изолировать популяции клеток имеет решающее значение для очерчивания функциональных возможностей этих клеток-мишеней при заданных условиях. Существует множество способов микроглии изоляции, но они ограничены по своей способности получать относительно высоких количеств и чистоты для широких экспериментов 13, 14, 15. Например, кластер дифференцировки 11b (CD11b) является общим поверхностным маркером моноцитов, макрофагов и микроглии 16. При эксплуатации CD11b, метод магнитной сепарации был впервые описан как подход колонке на основе , которая давала ~ 99,5% чистоты и ~ 1,6 × 10 6 микроглии в неонатальном мозге 17. В нашей лаборатории недавно разработала CD11b магнитный метод разделения без колонн 15, который мы провели в полистирольной трубке, помечая CD11b с моноклональным антителом , конъюгированным с фикоэритрином (PE). Биспецифическое SecondaRy антитела к РЕ и декстран комплексы с ПЭ. После связывания, декстран покрытием магнитные частицы вводятся, которые связываются с декстрана конце комплекса антитела. Наконец, полистирола пробирку помещают в магнит для микроглии изоляции. Этот подход в два раза выход до ~ 3,2 × 10 6 микроглии в неонатальном мозге , но за счет снижения чистоты до ~ 97%.

В данном случае мы демонстрируем быстрый и рафинированный без колонн CD11b магнитной сепарации протокола (Рисунок 1). Этот усовершенствованный метод остается, насколько это возможно, как наш оригинальный метод без колонн, так как цена комплекта магнитной сепарации CD11b является то же самое. Время завершения уменьшается в два раза, что может иметь решающее значение для максимизации выживаемости клеток и выход. Следует отметить, что чистота достигается с этим оптимизированным метода составляет ~> 99%, значительное улучшение по чистоте , достигнутой от первоначального способа без колонн , разработанного нашей лабораторией 15. Самое главное, что CD11b-PEне используется, исключая необходимость инкубировать в защищенном от света и позволяет использовать красный канал для флуоресцентной микроскопии. И, наконец, как в оригинальном способе CD11b, астроциты фракции с высоким выходом и чистоты получается с этим усовершенствованным способом. Астроциты являются наиболее многочисленные глиальные клетки в ЦНС, что приводит к тому , что их гомеостатические функции являются обязательными в отношении патофизиологии 18. Эти глиальные клетки играют важную роль в различных физиологических функций, таких как формирование гематоэнцефалический барьер, обеспечивая питательную поддержку, поддерживая нейромедиатора гомеостаза, образуя глиальные рубцы в ответ на повреждение, нейропротекции, обучения и памяти, а также нейровоспаления, иллюстрирующих их следственную потенциал в глиальных биология 19. Морфология и функциональность микроглии и астроцитов уже было установлено с помощью конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга, количественное в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР QRT), GРисс анализа нитрита, а также мультиплексной цитокин анализа Luminex. Уточнение предусмотрено этот протокол обеспечивает повышенную уверенность , относящуюся к микроглии или астроцитов чистоты, более широкому применению флуоресцентной микроскопии с наличием красного канала, а также экономит время, все из которых имеет важное значение для экспериментов в пробирке.

Protocol

Использование животных и протокольные процедуры были утверждено и контролируется по уходу и использование комитет Институциональных животных (IACUC) в Университете штата Айова (Ames, IA, США) по 1. Выращивание смешанных глиальных культур Обезглавьте 1- 2 дневных щенков б…

Representative Results

Микроглия изолированы с использованием набора CD11b-позитивной селекции II, имеют высокую чистоту Первичные микроглии мыши были выделены с использованием вышеуказанного протокола и высевали на покровные поли-D-лизин-покрытием, чтобы про?…

Discussion

Старые способы микроглии изоляции имеют ограниченные извлечения, которые не подходят для различных белков анализов методом вестерн-блоттинга и РНК с помощью анализа QRT-PCR. Дифференциальное сцепление и мягкие методы трипсина два общих подход с низкими выходами микроглии 13,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья (NIH) гранты: NS088206 и ES026892. W. Eugene и Линда Ллойд Обеспеченный Председатель в АГК и деканы профессура АК также признал.

Materials

EasySep CD11b Separation Kit II StemCell Technologies 18970
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
DMEM/F12 (1:1) (1x) Life Technologies  11330057
Sodium Pyruvate Life Technologies  11360070
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies  11140050
L-Glutamine (100x) Life Technologies  25030081
EDTA Fisher Scientific AM9260G
Fetal Bovine Serum Sigma 13H469
0.25% Trypsin-EDTA Gibco by Life Technologies 25200
Dulbecco's PBS Gibco by Life Technologies 14190250

References

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson’s disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson’s Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson’s Disease: Foe and ally?. Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson’s disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

Play Video

Cite This Article
Sarkar, S., Malovic, E., Plante, B., Zenitsky, G., Jin, H., Anantharam, V., Kanthasamy, A., Kanthasamy, A. G. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J. Vis. Exp. (122), e55364, doi:10.3791/55364 (2017).

View Video